譚雄斯，龐武耀（肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廣東 肇慶 526020）

·實(shí)驗(yàn)研究·

HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定金嗓散結(jié)膠囊中6種主要成分的含量

譚雄斯，龐武耀（肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廣東 肇慶 526020）

目的：建立同時(shí)測(cè)定金嗓散結(jié)膠囊中6種主要成分的HPLC梯度洗脫方法。方法：選用Venusil MP C18色譜柱；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.03%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0 ～ 9 min 15.0%A，9 ～ 16 min 15.0%→21.0%A，16 ～ 22 min 21.0%→36.0%A，22 ～ 30 min 36.0%→55.0%A，30 ～ 37 min 55.0%→75.0%A，37 ～ 45 min 75.0%→15.0%A；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm（苦杏仁苷、哈巴苷）、280 nm（安格洛苷C、哈巴俄苷）和208 nm（24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B）。結(jié)果：苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B分別在一定的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r ≥ 0.9992）；平均回收率96.77% ～ 100.05%，RSD值0.60% ～ 1.55%；精密度和重復(fù)性良好；室溫下金嗓散結(jié)膠囊供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于金嗓散結(jié)膠囊中6種主要成分含量的同時(shí)測(cè)定。

金嗓散結(jié)膠囊；苦杏仁苷；哈巴苷；安格洛苷C；哈巴俄苷；24-乙酰澤瀉醇A；23-乙酰澤瀉醇B

[KEY WORDS]Jinsangsanjie capsules; Amygdalin; Harpagide; Angoroside C; Harpagoside; 24-acetate alisol A; 23-acetate alisol B

金嗓散結(jié)膠囊由桃仁、玄參、澤瀉等16味中藥材加工而成，具有清熱解毒、活血化瘀、利濕化痰的功效，對(duì)慢喉喑（聲帶小結(jié)、聲帶息肉、聲帶黏膜增厚）及由此而引起的聲音嘶啞等癥狀的治療效果明顯。張甦琳等[1]采用金嗓散結(jié)膠囊對(duì)75例聲帶息肉及聲帶小結(jié)患者進(jìn)行治療，結(jié)果顯示金嗓散結(jié)膠囊安全方便，對(duì)聲帶息肉及聲帶小結(jié)療效顯著，聲帶小結(jié)總有效率達(dá)到93.8%，聲帶息肉總有效率達(dá)到89.7%，室?guī)⑷饪傆行蔬_(dá)到100.0%，聲帶小結(jié)伴急性充血、聲帶息肉伴急性充血總有效率達(dá)到100.0%，聲帶慢性充血伴肥厚總有效率達(dá)到66.7%。賢清惠[2]報(bào)道重用玄參治療聲帶息肉效果顯著。金嗓散結(jié)膠囊收錄于中藥成方制劑第12冊(cè)，其主藥桃仁、紅花、貝母行氣活血、化淤通絡(luò)、化痰散結(jié)，輔以玄參、澤瀉、金銀花、蒲公英，共達(dá)淤行痰化結(jié)散之功效。標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了其性狀、鑒別及膠囊劑通則項(xiàng)下的檢測(cè)項(xiàng)目[3]，未對(duì)方中的主要藥物進(jìn)行定量測(cè)定控制，為確保用藥安全，全面控制本品質(zhì)量，筆者對(duì)桃仁中的苦杏仁苷，玄參中的哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷，澤瀉中的24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B采用HPLC波長(zhǎng)切換法進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，可用于金嗓散結(jié)膠囊的質(zhì)量控制和治療藥物監(jiān)測(cè)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200系列四元梯度泵高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AG-245型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SB-5200DTD超聲波發(fā)生器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

金嗓散結(jié)膠囊（西安碑林藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.4 g，批號(hào)：JA116010011、JA116020051、JA116050091）；苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：110820-201607，含量90.7%，2 ～ 10 ℃冷處保存）、哈巴苷對(duì)照品（批號(hào)：111729-201506，含量95.9%）、哈巴俄苷對(duì)照品（批號(hào)：111730-201307，含量97.1%，極具引濕性開封后一次使用完畢）、23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品（批號(hào)：111846-201504，含量99.0%，冷凍保存）購于中國食品藥品檢定研究院；安格洛苷C對(duì)照品（批號(hào)：115909-22-3，含量98.0%）購于上海寶曼生物科技有限公司；24-乙酰澤瀉醇A對(duì)照品（批號(hào)：18674-16-3，含量98.0%）購于寶雞辰光生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.03%磷酸溶液，梯度洗脫（0 ～ 9 min，15.0%A；9 ～ 16 min，15.0%→21.0%A；16 ～ 22 min，21.0%→36.0%A；22 ～ 30 min，36.0%→55.0%A；30 ～ 37 min，55.0%→75.0%A；37 ～45 min，75.0%→15.0%A）；0 ～ 22 min時(shí)在210 nm[4-6]波長(zhǎng)下檢測(cè)苦杏仁苷和哈巴苷，22 ～ 30 min在280 nm[7-8]波長(zhǎng)下檢測(cè)安格洛苷C和哈巴俄苷，30 ～ 45 min在208 nm[9-10]波長(zhǎng)下檢測(cè)24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取對(duì)照品苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B各適量，用50%甲醇分別制成每毫升中含苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B各1.418、2.634、1.196、0.832、0.524、0.430 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再分別依次量取上面的各對(duì)照品儲(chǔ)備液：5.0、5.0、5.0、5.0、2.5、2.0 mL，置同一100 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入50%甲醇適量，SB-5200DTD超聲波發(fā)生器超聲處理30 min，放冷，用50%甲醇加至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十二冊(cè)中金嗓散結(jié)膠囊的處方及工藝過程，制備不含桃仁（去皮）、玄參和澤瀉的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

精密吸取“2.2.1 ～ 2.2.3”項(xiàng)下的溶液各適量，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件及方法進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性樣品溶液的色譜圖中，在對(duì)照品混合溶液所顯示的苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B對(duì)應(yīng)的位置無干擾，各峰之間的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均大于3000，詳見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，將其置于20 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得到一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按照上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，采用質(zhì)量濃度（X）作為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，如表1所示。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The results of the linear relationship test

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取對(duì)照品苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B各適量，用50%甲醇分別溶解并稀釋制成含苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B為0.509、0.758、0.677、0.572、0.380、0.254 mg·mL-1對(duì)照品溶液，備用。

取金嗓散結(jié)膠囊（批號(hào)：JA116010011）6份，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5 g，研細(xì)，置25 mL量瓶中，依次精密加入上述備用對(duì)照品溶液適量，再按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備樣品，作為加樣回收樣品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件及檢測(cè)方法，計(jì)算苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的回收率及相應(yīng)的RSD，詳見表2。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取金嗓散結(jié)膠囊樣品（批號(hào)：JA116010011），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件及檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的含量，并計(jì)算所測(cè)組分含量的RSD，結(jié)果所測(cè)6個(gè)組分的RSD依次為1.02%、0.57%、1.26%、0.81%、0.73%和1.69%。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及方法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果顯示苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD（n=6）分別為0.62%、1.01%、0.55%、0.89%、1.07%和1.09%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液（批號(hào)：JA116010011），在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及方法測(cè)定，測(cè)定苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的峰面積值，并求得這6個(gè)組分峰面積的RSD分別為0.88%、0.74%、1.06%、0.92%、1.15%和1.21%。結(jié)果表明室溫下金嗓散結(jié)膠囊中苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的回收率Tab 2 Recovery test results of amygdalin, harpagide,angoroside C, harpagoside, 24-acetate alisol A and 23-acetate alisol B

2.9 樣品測(cè)定

取三批金嗓散結(jié)膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備金嗓散結(jié)膠囊供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果. mg·g-1Tab 3 Results of content determination. mg·g-1

3 討論

3.1 色譜條件的考察

分別考察乙腈-水流動(dòng)相體系[5,8-10]、乙腈-冰醋酸溶液流動(dòng)相體系[11]和乙腈-磷酸溶液流動(dòng)相體系[4,6-7]，以基線的平穩(wěn)情況、所測(cè)各成分苦杏仁苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B的峰形以及分離情況為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的流動(dòng)相體系，對(duì)比結(jié)果顯示以乙腈-磷酸溶液為流動(dòng)相體系時(shí)，所測(cè)各組分峰形對(duì)稱，所測(cè)各成分色譜峰分離度符合要求，基線較平穩(wěn)。在此基礎(chǔ)上又對(duì)磷酸溶液的濃度進(jìn)行摸索，最終確定以乙腈-0.03%磷酸溶液為流動(dòng)相，并按照文中的比例梯度洗脫對(duì)金嗓散結(jié)膠囊中6個(gè)成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

3.2 供試品提取方式的確定

在供試品溶液的制備實(shí)驗(yàn)中，作者分別考察了提取方法（回流、超聲、索氏）及提取溶劑（50%甲醇、甲醇、乙醇），結(jié)果顯示，以50%甲醇超聲提取時(shí)操作最為簡(jiǎn)便、所測(cè)各成分的提取效率最佳。在此基礎(chǔ)上又分別對(duì)提取時(shí)間（15、30、45 min）及溶劑量（1 g : 20 mL，1 g : 25 mL，1 g : 50 mL）進(jìn)行了考察，最終優(yōu)選最佳的供試品溶液制備方法為：供試品中加入25倍量的50%甲醇溶液，超聲提取30 min。

綜上，本研究采用簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的高效液相波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法測(cè)定金嗓散結(jié)膠囊中6個(gè)成分的含量，為金嗓散結(jié)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了數(shù)據(jù)支持，具有一定的實(shí)際意義。本文采用波長(zhǎng)切換法同時(shí)對(duì)金嗓散結(jié)膠囊中6個(gè)成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，也存在一定的不足之處，對(duì)照品使用量較大，尤其對(duì)于極具引濕性、要求開封后一次使用完畢的哈巴俄苷對(duì)照品，檢驗(yàn)成本偏高。采用一測(cè)多評(píng)法對(duì)金嗓散結(jié)膠囊中多組分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定有待更深入的研究。

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Simultaneous determination of six main constituents in Jinsangsanjie capsules by HPLC gradient elution

TAN Xiong-si, PANG Wu-yao(Zhaoqing Medical College, Zhaoqing 526020, China)

Objective:To establish the quantitative method to determine six main constituents simultaneously in Jinsangsanjie capsules by HPLC gradient elution.Methods:The separation was performed on Venusil MP C18chromatographic column by HPLC gradient elution. The mobile phase consisted of acetonitrile (A) and 0.03% phosphoric acid solution (B).Gradient elution was as follows: 0 – 9 min 15.0%A, 9 – 16 min 15.0%→21.0%A, 16 – 22 min 21.0%→36.0%A, 22 – 30 min 36.0%→55.0%A, 30 – 37 min 55.0%→75.0%A, 37 – 45 min 75.0%→15.0%A. The flow rate was 0.8 mL·min-1. The column temperature was set at 30 ℃ . The sample quantity was 10 μL. The detection wavelength were set at 210 nm (amygdalin, harpagide),280 nm (angoroside C, harpagoside) and 208 nm (24-acetate alisol A, 23-acetate alisol B).Results:Amygdalin, harpagide,angoroside C, harpagoside, 24-acetate alisol A and 23-acetate alisol B had a good linear relationship in a certain linear range (r ≥ 0.9992)respectively. The average recovery was 96.77% – 100.05% and the corresponding RSD was 0.60% – 1.55%. The precision and the repeatability were good. Test solution was stable at room temperature within 12 h.Conclusion:The method was reliable, simple. It could be used for the simultaneous determination of 6 main components in Jinsangsanjie capsules.

R917

A

1672 – 8157(2017)05 – 0263 – 04

2016年肇慶市科技創(chuàng)新指導(dǎo)類項(xiàng)目（201624030406）

譚雄斯，男，藥師，副教授，主要從事藥物分析、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及藥學(xué)教育工作。E-mail：tanxiongsizhaoqing@163.com

2017-01-08

2017-03-06）