郭伊霖，宗時(shí)宇，浦益瓊，徐本亮，王 冰

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

響應(yīng)面法優(yōu)化徐長卿中丹皮酚提取工藝研究

郭伊霖，宗時(shí)宇，浦益瓊，徐本亮，王 冰

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

目的利用響應(yīng)面法優(yōu)選徐長卿中丹皮酚的最佳提取工藝。方法采用水蒸氣蒸餾法提取徐長卿中丹皮酚，采用響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝，以浸泡時(shí)間（A）、液料比（B）、氯化鈉量（C）為自變量，以歸一值(OY值，Y）為因變量，分別進(jìn)行多元線性方程回歸和二次多項(xiàng)式方程擬合，優(yōu)選最佳提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果最佳提取工藝為浸泡時(shí)間3 h，料液比1∶15，氯化鈉量150 g／kg。結(jié)論該優(yōu)選工藝可用于徐長卿中丹皮酚的提取，方法簡便、穩(wěn)定、可行。

響應(yīng)面法；水蒸氣蒸餾法；徐長卿；丹皮酚；提取工藝

中藥徐長卿為蘿摩科植物徐長卿 Cynanchum paniculatum（Bge.） Kitag.的干燥根和根莖，性溫，味辛，具祛風(fēng)化濕、止痛止癢、溫經(jīng)通絡(luò)、活血解毒、利水消腫之功效，常用于治療風(fēng)濕痹痛、胃痛牙痛、跌打損傷、濕疹、蕁麻疹等癥[1]。徐長卿藥材中揮發(fā)油含量較高，其中丹皮酚的含量高達(dá)94.7%，是主要活性成分[2]。丹皮酚具有顯著的抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)作用，對脾臟、胸腺等免疫器官及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫分子均有顯著調(diào)節(jié)作用[3]。盡管丹皮酚可化學(xué)合成，但市售的丹皮酚提取物多來源于徐長卿、牡丹皮等中藥材，制得的丹皮酚不僅純度高而且安全性好[4]。因此，需進(jìn)一步改進(jìn)其提取工藝，以更好地滿足臨床需求。

丹皮酚是小分子酚類化合物，熔點(diǎn)低，易揮發(fā)，水溶性差。徐長卿中丹皮酚的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、超聲波輔助提取法、CO2超臨界流體萃取法及溶劑浸潤提取法等[5]。其中，溶劑浸潤提取法耗費(fèi)溶劑且提取物純度低，CO2超臨界流體萃取法的設(shè)備投資成本高，超聲波輔助提取法尚未完善中試放大工藝，而水蒸氣蒸餾法則不需要特殊儀器，既適用于小型實(shí)驗(yàn)室制備，又方便投入大生產(chǎn)，最重要的是可直接獲得丹皮酚晶體，且晶體純度較高，整體成本非常低[6]。因此，本研究中擬選用水蒸氣蒸餾提取法，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)選徐長卿中丹皮酚的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技公司）；DZF－6050型真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；KH－400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；TGL－20B型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XS105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；BS124S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；電熱套（江蘇近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠）；蒸餾裝置（上海青陽生物科技有限公司）。

1.2 試藥

丹皮酚對照品（批號為110708－201407，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；試驗(yàn)用水為純凈水（杭州娃哈哈百立食品有限公司）；氯化鈉（分析純，批號為 20160428，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。徐長卿飲片（批號為150613）購自上海康橋中藥飲片有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)張紅梅博士鑒定為徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.） Kitag.。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法建立

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Ultimate? XB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 水（65 ∶35），流速：1.0 mL ／min；檢測波長：274 nm；柱溫：25℃。理論板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.1.2 溶液制備

對照品貯備液：稱取丹皮酚對照品10.38 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻，制得質(zhì)量濃度為207.6 μg／mL的對照品貯備液，于4℃保存。

供試品溶液：稱取丹皮酚結(jié)晶，精密稱定，用甲醇溶解稀釋至一定質(zhì)量濃度，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密稱取一定量丹皮酚結(jié)晶，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別取空白甲醇溶液、供試品溶液及對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，利用高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)測定。結(jié)果空白甲醇對丹皮酚的測定無干擾。結(jié)果見圖1。

線性關(guān)系考察：取對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋成 質(zhì) 量 濃 度 為 5.19， 10.38， 20.76， 41.52， 83.04，166.08 μg／mL 的系列溶液，搖勻，作為對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液各10 μL，分別注入HPLC儀，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg／mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，回歸方程 Y＝51.763 X＋14.162，r＝1.000(n＝6)。結(jié)果表明，丹皮酚質(zhì)量濃度在5.19～166.08μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為 5.19，41.52，166.08 μg／mL 的對照品溶液，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件，1 d內(nèi)連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，連續(xù)測定3 d，記錄峰面積。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液色譜日內(nèi)精密度的RSD 依次為 0.53% ，0.20% 和 0.31% ，日間精密度的RSD 依次為 2.80% ，0.87% 和 0.47% ，RSD 均小于3.00%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，依法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果的 RSD為2.30%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于室溫放置 0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果峰面積的RSD為1.10%(n＝7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取適量已知純度（94.10%）的丹皮酚結(jié)晶，平行9份，每3份為1組，分低、中、高濃度3組，分別加入相當(dāng)于樣品含量的50%，100%，150%的丹皮酚對照品溶液，用甲醇溶解稀釋至線性范圍，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定丹皮酚的含量，并計(jì)算低、中、高3種質(zhì)量濃度的加樣回收率。結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 徐長卿中丹皮酚含量測定

按照 2015年版《中國藥典（一部）》方法，稱取約0.5 g徐長卿飲片粗粉，置100 mL具塞錐形瓶中，平行取3份，分別精密加入50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取1 mL續(xù)濾液，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。以2.1項(xiàng)下色譜條件測定徐長卿飲片中丹皮酚的含量。結(jié)果顯示，該批徐長卿中丹皮酚含量為1.68%（RSD ＝1.90%），符合藥典規(guī)定。

2.3 提取工藝考察

2.3.1 提取工藝

稱取約40 g徐長卿粗粉，置1 000 mL圓底燒瓶中，加入一定量的蒸餾水和氯化鈉浸潤一定時(shí)間后，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，至再無渾濁餾出液滴出時(shí)停止蒸餾，將餾出液重蒸餾，收集餾出液于4℃冷藏、靜置48 h后，抽濾收集結(jié)晶，25℃干燥稱重，即得丹皮酚結(jié)晶[7]。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

采用Box－Benhnken設(shè)計(jì)BBD－響應(yīng)面法，以丹皮酚純度（Y1）和丹皮酚得率（Y2）為指標(biāo)，料液比、浸泡時(shí)間、NaCl加入量為影響因素，使用 Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及對結(jié)果進(jìn)行分析，優(yōu)化篩選丹皮酚的最佳提取工藝。因純度與得率均是越高越好，故本試驗(yàn)中采用總評“歸一值（OY）”法進(jìn)行綜合考察。因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

利用軟件 Design Expert 8.0.6[8－10]設(shè)計(jì)出 17 組試驗(yàn)，其中包括12個(gè)析因點(diǎn)試驗(yàn)和5個(gè)用于估計(jì)試驗(yàn)誤差的中央點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，丹皮酚的得率為0.74% ～ 1.06% ，且純度均高于 90.00% ，最高可達(dá)98.39%。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

對OY值[OY＝（Y1／Y1max）×0.9＋（Y2／Y2max）×0.1]，進(jìn)行多元線性方程回歸和二次多項(xiàng)方程擬合，得響應(yīng)值OY對自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：

繪制上述擬合回歸方程的三維效應(yīng)面和二維等高圖，見圖2。優(yōu)選出丹皮酚提取的最佳工藝為料液比1∶15，NaCl量 6 g（150 g ／kg），浸泡時(shí)間 3 h。由于每個(gè)因素只有3個(gè)水平，因此選擇BBD－響應(yīng)面法較星點(diǎn)設(shè)計(jì)CCD－響應(yīng)面法更經(jīng)濟(jì)、高效，減少試驗(yàn)次數(shù)的同時(shí)，又保證了試驗(yàn)精度[11]。

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.4 最優(yōu)提取工藝條件驗(yàn)證

以選出的最佳提取工藝，分別進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果見表4。實(shí)測值與預(yù)測值偏差較小，說明建立的模擬回歸方程預(yù)測性較好，其所優(yōu)選出的最佳提取工藝重復(fù)性良好（RSD＜3.00%），該工藝所獲得的結(jié)晶純度可達(dá)95.60%，說明提取獲得的丹皮酚純度較高。

表4 預(yù)測值與實(shí)際值的比較

3 討論

響應(yīng)面法是采用非線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，用三維效應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化來預(yù)測最佳試驗(yàn)條件，精度高、預(yù)測性好、簡便，解決了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)只能對孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析，無法找出整個(gè)區(qū)域的最佳組合缺點(diǎn)[12]。本研究中采用BBD－響應(yīng)面分析法，建立模擬回歸方程，并繪制響應(yīng)值 OY對自變量的效應(yīng)面，從而成功優(yōu)選出徐長卿中丹皮酚的最佳提取工藝：料液比為1∶15，NaCl量為150 g／kg，浸泡時(shí)間為3 h。該工藝不僅穩(wěn)定可行，且獲得的丹皮酚結(jié)晶純度高（95.60%），可為后期的制劑研究及藥效評價(jià)提供高純度樣品制備方法，及為課題后續(xù)開展提供試驗(yàn)依據(jù)。

圖2 各因素間的響應(yīng)面圖和等高線圖

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Optimization of Extraction Process of Paeonol in Cynanchum Paniculatum by Response Surface Method

Guo Yilin，Zong Shiyu，Pu Yiqiong，Xu Benliang，Wang Bing
（ Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai， China 201203）

Objective To optimize the extraction process of paeonol in Cynanchum paniculatum by response surface method（RSM）.Methods The paeonol was extracted in Cynanchum paniculatum by steam distillation.The extraction process was optimized by RSM，the effect of extraction time （A），ratio of liquid to material （B） and amount of sodium chloride （C） as the independent variable，OY Value（Y） as the dependent variable，the multiple linear equation regression and the quadratic polynomial equation fitting were carried out respectively，and the optimal extraction process was selected and validated.Results The optimal extraction conditions were as follows：immersion time was 3 h，ratio of material to liquid was 1 ∶15，and sodium chloride was 150 g ／kg.Conclusion The optimization process can be used to extract paeonol in Cynanchum paniculatum，the method is simple，stable and feasible.

response surface method；steam distillation； Cynanchum paniculatum；paeonol；extraction process

TQ460.6；R284.1

A

1006－4931(2017)20－0009－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.003

上海市教育委員會預(yù)算內(nèi)科研項(xiàng)目[2014YSN28]。

郭伊霖，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)，（電話）021－51322352（電子信箱）gyl101010＠126.com。

王冰，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)橹兴幖{米給藥系統(tǒng)，（電話）021－51323123（電子信箱）annabel＿cn＠163.com。

2017－06－06)