楊春艷,馮朝暉,楊 萍,任 平

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 心內(nèi)科,吉林 長春130033;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 胸外科)

Ghrelin對(duì)心梗后心衰大鼠心功能的影響及機(jī)制研究

楊春艷1,馮朝暉1,楊 萍1,任 平2*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 心內(nèi)科,吉林 長春130033;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 胸外科)

目的闡明Ghrelin對(duì)心梗后心衰大鼠心功能的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支構(gòu)建心梗后心衰大鼠模型，并在術(shù)后將動(dòng)物隨機(jī)分為模型組和Ghrelin治療組 ，并設(shè)立假手術(shù)組對(duì)照。術(shù)后第5周開始皮下注射Ghrelin，連續(xù)給藥4周。通過血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)及心臟超聲檢查評(píng)價(jià)心功能，HE染色觀察心肌重構(gòu)，TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，并應(yīng)用ELISA檢測(cè)血管緊張素II(Ang II)水平。結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的左室舒張末壓(LVEDP)明顯增加，左室收縮末壓(LVSP)與射血分?jǐn)?shù)(EF)明顯下降；心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，心肌重構(gòu)顯著；Ang Ⅱ水平明顯增高。與模型組相比，Ghrelin治療組LVSP 及EF顯著提高，LVEDP顯著降低；心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，心肌重構(gòu)減輕；Ang Ⅱ水平明顯下降。結(jié)論Ghrelin可抑制心肌細(xì)胞凋亡改善心肌重構(gòu)，進(jìn)而提高心衰大鼠心功能，其機(jī)制可能與Ghrelin下調(diào)Ang II抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的激活有關(guān)。

心力衰竭;Ghrelin;血管緊張素Ⅱ;心肌細(xì)胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:1812)

各種心血管疾病進(jìn)展的最終歸宿是慢性心力衰竭(CHF)，其發(fā)病率高，是心血管疾病患者致殘及死亡的重要原因，已成為我國及其他國家主要的公共衛(wèi)生問題[1,2]。促生長激素釋放多肽(Ghrelin)是生長激素促分泌素(GHS)受體的內(nèi)源性配體，具有多種生物學(xué)活性，包括刺激生長激素(GH)分泌、調(diào)節(jié)代謝、促進(jìn)攝食與肥胖等[3]。在心血管方面，已有研究表明Ghrelin可以增加心肌收縮力、舒張血管及保護(hù)心梗后心衰的形成等作用[4-8]。且有研究進(jìn)一步表明Ghrelin及其受體GHSR-1a可在心臟表達(dá)[9]，并與心臟上的結(jié)合位點(diǎn)具有高度親合力[10-12]，此研究提示Ghrelin的心血管保護(hù)作用可不依賴于GH而獨(dú)立存在，但其具體的細(xì)胞與分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討Ghrelin對(duì)心梗后心衰大鼠心功能的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物本研究應(yīng)用的是由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的體重200-220 g的雌性Wistar大鼠，合格證號(hào)：SCXK-(吉)2003-0001。

1.2主要試劑?；疓hrelin購自于中肽生物科技有限公司，Ang II ELISA檢測(cè)試劑盒購自上海朗頓生物技術(shù)有限公司，HE染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，TUNEL檢測(cè)試劑盒購自羅氏公司(South San Francisco,California,USA)。

1.3大鼠心衰模型制備及分組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，模型動(dòng)物行左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)，方法如下：乙醚吸入麻醉，備皮，局部消毒，先用10號(hào)縫線在開胸部位做一荷包，迅速開胸暴露心臟，模型組用0號(hào)線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。術(shù)后迅速收攏荷包關(guān)閉胸腔，手術(shù)部位涂敷0.2%呋喃西林軟膏，并常規(guī)給予腹腔注射青霉素(20萬U/kg)7天。術(shù)后4周模型組存活大鼠20只，隨機(jī)分為模型組(MI 組：皮下注射與Ghrelin等體積的0.9%生理鹽水，2次/日)；模型-Ghrelin組(MI-Ghrelin 組：皮下注射Ghrelin 0.2 mg/kg，2次/日)。并設(shè)有假手術(shù)組(SO 組：皮下注射與Ghrelin等體積的0.9%生理鹽水，2次/日)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠藥物干預(yù)4周后終止飼養(yǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4心臟超聲檢測(cè)給藥結(jié)束后，乙醚吸入麻醉后于左胸上至鎖骨下至肋骨下緣處備皮，對(duì)大鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)超聲檢測(cè)結(jié)束后，進(jìn)行有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，方法簡述如下：經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈逆行插入左心室，待穩(wěn)定后通過RM-6000型八通道生理記錄儀記錄左心室收縮末壓(LVSP)，左心室舒張期末壓(LVEDP)以及左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dt max)。

1.6HE染色切取非梗死區(qū)心室肌組織約2 mm厚，用4%多聚甲醛固定72 h，之后常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm厚)，二甲苯脫蠟，下行梯度酒精水化，按試劑盒說明書進(jìn)行蘇木素及伊紅染色，于顯微鏡下觀察染色程度。待染色結(jié)束后，上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.7心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)應(yīng)用原位末端標(biāo)記檢測(cè)法(TUNEL)進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟按TUNEL說明書進(jìn)行。染色結(jié)束后于暗室光鏡下觀察，細(xì)胞核呈綠色熒光即為TUNEL陽性細(xì)胞。

1.8AngII水平檢測(cè)按照試劑盒操作說明檢測(cè)外周血及心肌組織Ang II水平， 測(cè)定450 nm波長光吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Ang II含量。

2 結(jié)果

2.1心功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：MI組大鼠LVEDP較SO組明顯增高，有顯著性差異(P<0.01)；LVSP及±dp/dt max(mmHg/s)均較SO組明顯降低，均有顯著性差異(P<0.01)；MI-Ghrelin組大鼠LVEDP較MI組明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；LVSP及±dp/dt max(mmHg/s) 較MI組均明顯升高，均有顯著性差異(P<0.05)；MI組大鼠EF值較SO組明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；MI-Ghrelin組大鼠EF較MI組明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)。見表1。上述結(jié)果提示：Ghrelin可明顯改善心梗后心衰大鼠心功能。

表1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

**P<0.01 vs.SO group;#P<0.05,##P<0.01 vs.MI group.

2.2心肌組織形態(tài)學(xué)檢查

心肌組織HE染色結(jié)果觀察如下：SO組心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰；MI組心肌纖維部分?jǐn)嗔?，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，大量纖維組織增生。MI-Ghrelin組與SO組比較，心肌細(xì)胞排列稍紊亂，有炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生；MI-Ghrelin組與MI組比較，斷裂心肌纖維減少，排列較整齊，炎細(xì)胞浸潤及纖維增生程度明顯減輕。見圖1。

2.3心肌組織細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)

為明確Ghrelin改善心梗后心衰大鼠心功能的機(jī)制，應(yīng)用TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MI組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率較SO組明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)；給予Ghrelin干預(yù)后，心衰大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率較未干預(yù)組明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)。見圖2和3。上述結(jié)果提示：心肌細(xì)胞凋亡是心衰進(jìn)展的重要因素，Ghrelin可能通過抑制心梗后心衰進(jìn)程中的心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善心梗后心功能。

圖1 HE染色法檢測(cè)大鼠心肌組織病理學(xué)改變(×200)

圖2 TUNEL染色法檢測(cè)大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡(×200)

**P<0.01 vs.SO group;##P<0.01 vs.MI group.

2.4外周血及心肌組織AngII水平檢測(cè)

為進(jìn)一步探討Ghrelin抑制心肌細(xì)胞凋亡改善心肌重構(gòu)的機(jī)制，研究還檢測(cè)了各組大鼠外周血與心肌組織Ang II水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿及心肌組織AngⅡ 顯著上升(P<0.01)；而給予Ghrelin治療后AngⅡ表達(dá)明顯下降(P<0.01)。提示：Ghrelin可能通過下調(diào)Ang II表達(dá)抑制RAAS激活，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能。

3 討論

雖然新型藥物和PCI等先進(jìn)技術(shù)的不斷出現(xiàn)明顯降低了急性心肌梗死的死亡率，但卻使心梗后心力衰竭的發(fā)生率逐年上升，流病學(xué)研究顯示目前全球心衰患者的人數(shù)高達(dá)2250萬人，并仍以每年200萬的速度遞增，且5年存活率與惡性腫瘤相似[13]。盡管人們對(duì)心衰的治療進(jìn)行了各種嘗試，但目前尚無逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)的有效手段。

表2 大鼠外周血及心肌組織Ang II水平

**P<0.01 vs.SO group;##P<0.01 vs.MI group.

心力衰竭的顯著特征之一是左心室收縮功能的進(jìn)行性減退，而導(dǎo)致左室功能衰退的重要因素之一是心肌細(xì)胞數(shù)目減少，心肌細(xì)胞數(shù)目減少的直接因素為心肌細(xì)胞凋亡。以往的研究表明，成年心肌細(xì)胞凋亡存在于人類和其他哺乳動(dòng)物的心肌組織[14]，且成年心肌細(xì)胞自我更新的能力非常有限[15]，因此，很少數(shù)量的成年心肌細(xì)胞凋亡即可對(duì)心功能造成持久的不良影響。本研究發(fā)現(xiàn)心衰大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組明顯增加，這可能是模型組大鼠出現(xiàn)心衰的直接原因，與前人的研究結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)心肌細(xì)胞凋亡是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。更重要的是研究發(fā)現(xiàn)給予外源性?；疓hrelin干預(yù)后，心衰大鼠的心功能明顯改善，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，提示Ghrelin可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡改善心功能。然而，心衰時(shí)心肌細(xì)胞凋亡的原因及誘因，以及Ghrelin抑制心衰心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

現(xiàn)已明確神經(jīng)內(nèi)分泌及細(xì)胞因子激活的一系列分子活動(dòng)導(dǎo)致心室重構(gòu)的組織學(xué)改變是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的實(shí)質(zhì)，而腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的激活是神經(jīng)內(nèi)分泌激活的關(guān)鍵，其在心力衰竭發(fā)生發(fā)展中起核心作用[16]。RAAS的持續(xù)激活，可促進(jìn)心肌纖維化、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致心肌肥厚、進(jìn)而引起心室重構(gòu)，加速心衰進(jìn)展；而心衰進(jìn)展又可進(jìn)一步促進(jìn)RAAS系統(tǒng)激活，形成惡性循環(huán)。RASS的核心分子是Ang II，心衰時(shí)由于有效循環(huán)血容量減少等因素可促使循環(huán)及心肌組織Ang II表達(dá)均增加。循環(huán)及心肌組織Ang II表達(dá)增加，在短期內(nèi)可通過收縮血管增加血壓、促進(jìn)鈉水潴留調(diào)節(jié)血容量等代償方式保護(hù)心功能；長期持續(xù)的增高則將通過升高血壓增加心臟負(fù)荷、促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、促進(jìn)心肌纖維化以及膠原合成、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡等導(dǎo)致心肌重構(gòu)，促進(jìn)心衰進(jìn)展[17-19]。因此，本研究為進(jìn)一步探討Ghrelin改善心梗后心衰的機(jī)制，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)外周血及心肌組織Ang II表達(dá)，明確Ghrelin對(duì)循環(huán)及組織Ang II的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ghrelin可明顯下調(diào)心衰大鼠循環(huán)及組織Ang II表達(dá)。提示：Ghrelin可能通過下調(diào)Ang II表達(dá)拮抗RAAS系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)心梗后心衰作用。

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EffectandMechanismofGhrelinonHeartFailureafterMyocardialInfarctioninRats

YANGChun-yan,FENGZhao-hui,YANGPing,etal.

(Departmentofcardiology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo clarify the effect and possible mechanism of ghrelin on heart failure (HF) after myocardial infarction (MI)．MethodsThe rat model of heart failure was induced by ligating the left anterior descending (LAD) of female Wistar rats ,and the animals were randomly divided into the model group (MI) and the ghrelin treatment (MI-Ghrelin) group after the operation,and the sham operation (SO) group was compared.In the 5th week of surgery,ghrelin administered by subcutaneous injection for 4 weeks.Then,the cardiac function was assessed by LV end-diastolic pressure (LVEDP),left ventricular systolic pressure (LVSP),± dp/dt max (mmHg/s) and ejection fraction (EF%).Hematoxylin and eosin (H&E) staining waw used to analyze the morphological changes in the myocardium and TUNEL assay was performed to detecte myocardial apoptosis.In addition,the serum and non-infarct myocardial tissue angiotensin II (Ang II) were measured using ELISA.ResultsCompared with the sham group，the number of myocardial apoptosis,the LVEDP and of model group increased significantly(P<0.05 ),the LVSP,EF and the level of Ang II were decreased significantly(P<0.05).However,ghrelin could significantly increase the EF and LVSP,decrease the LVEDP,reduce the number of cardiomyocyte apoptosis,and down-regulated the expression of Ang II.ConclusionBy down-regulating the Ang II expression in myocardial cells in rat HF after MI,ghrelin treatment decreased the apoptosis of myocardial cells,suggesting the possible mechanism by which ghrelin functions in protecting against heart failure.

heart failure;ghrelin;angiotensin II;myocardial apoptosis

R541.6+1

A

2017-06-25)

國家自然科學(xué)基金(81570360,81400298)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1812-04

楊春艷(1980- )，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事心力衰竭發(fā)病機(jī)制及治療研究。