王新梅，王雪野，韓 梅*，肖中平

(吉林省人民醫(yī)院 1.血液科;2.腫瘤科，吉林 長春130021)

人體外周血CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞體外擴增的實驗研究

王新梅1，王雪野2，韓 梅1*，肖中平1

(吉林省人民醫(yī)院 1.血液科;2.腫瘤科，吉林 長春130021)

目的探討人體外周血CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞(DNT細胞)在體外進行分離和擴增的方法。方法取健康的成人外周血20 ml，應(yīng)用Rosettesep抗體吸附法去除CD4+T細胞和CD8+T細胞；再將DNT細胞放入anti-CD3mAb包被的培養(yǎng)板中，并加入rhIL-2、rhIL-4，共同培養(yǎng)，第10天和第14天計數(shù)細胞擴增倍數(shù)及記錄擴增曲線；利用Easysep免疫磁珠法純化，采用流式細胞儀檢測其純度。結(jié)果經(jīng)分選、純化后的DNT細胞，純度可達94%以上；體外培養(yǎng)第10天和第14天，DNT細胞擴增倍數(shù)分別為53倍和41倍。結(jié)論通過Rosettesep抗體吸附法及Easysep免疫磁珠法分離及純化DNT細胞是可行的，可獲得大量高純度的DNT細胞。

CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞；Rosettesep抗體吸附法；Easysep免疫磁珠法；流式細胞術(shù)

(ChinJLabDiagn,2017,21:1831)

免疫調(diào)節(jié)性T細胞是人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫耐受的重要機制，近年來由于免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，免疫調(diào)節(jié)性T細胞越來越受到人們的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)這類細胞在機體的自身免疫、腫瘤免疫以及器官移植等方面都具有重要的作用。目前被證實的具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答功能的細胞主要包括：免疫抑制性CD8+CD28-T細胞、γδTCR+T細胞、自然殺傷(NK) T細胞、CD8+否決細胞以及CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞(double negative T cells，DNT細胞)[1]。其中DNT細胞具有獨特的生物學(xué)功能，主要與其表面標志不同及分泌特殊的效應(yīng)因子有關(guān)[2,3]。然而，DNT細胞在正常人和小鼠的外周血T淋巴細胞中的數(shù)量極少，僅占1%-2%和1%-5%[4-6]，這就限制了對其功能的進一步研究。因此，對于DNT細胞的體外擴增方法及優(yōu)化，成為目前亟待解決的問題。本課題研究的目的為體外分離和培養(yǎng)外周血DNT細胞，獲取一定數(shù)量高純度的DNT細胞，為進一步研究其作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1標本來源

每年進行健康體檢志愿者5名，其中男2名，女3名，年齡21-44歲，中位年齡33歲。于清晨、空腹、采集肝素抗凝靜脈血20 ml。

1.2試劑和儀器

抗-CD3 單抗購自美國eBioscience公司；rh IL-2，rh IL-4購自美國PEPROTECH公司；Rosettesep CD4、CD8負選試劑盒、Easysep CD4、CD8、CD56正選試劑盒、磁極均購自于加拿大STEMCELL公司；淋巴細胞分離液購自達科為生物技術(shù)有限公司；CD3-PC5/ CD4-FITC /CD8-PE，CD3-FITC/CD56-PE，流式細胞儀(EPICS XL)均產(chǎn)自于美國貝克曼-庫爾特公司；5 ml聚苯乙烯試管，購自于美國BD公司；多標記微孔板分析儀1420，購自美國PerkinElmer Victor公司。

1.3實驗方法

1.3.1Rosettesep抗體吸附法分離DNT細胞 新鮮肝素抗凝靜脈血20 ml，加入Rosettesep Human CD4和 CD8 Depletion Cocktail各 50 μl/mL，在室溫條件下，孵育20 min；加入PBS+2%FBS 10 ml；加入到15 ml Ficoll中，于2 300 rpm離心30 min。取上、中層交界的白色云霧狀液體層，再加入PBS+2%FBS稀釋，于1 200 rpm離心10 min，棄上清，重復(fù)2次。計數(shù)細胞，以細胞培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1.0×106/mL。

1.3.2DNT細胞的體外培養(yǎng) 準備24孔板，用anti-CD3mAb 100 ng/mL包被，封口膜封口，孵箱過夜。以適量PBS+2%FBS洗板3次，分別加入RPMI-1640，10% FBS，鏈霉素100 μg/mL，青霉素100 U/mL，rhIL-2 50 U/mL，rhIL-4 30 U/mL。將細胞濃度調(diào)整為1×106個/mL的DNT細胞加入24孔板，每孔加2 ml。每3天換液1次。共培養(yǎng)10-14天。

1.3.3DNT細胞的純化 收集24孔板中細胞，計數(shù)細胞并調(diào)整細胞濃度為1×108個/mL，放入聚苯乙烯試管中，加入Easysep Human CD4 Positive Selection Cocktail 、Easysep Human CD8 Positive Selection Cocktail、 Easysep Human CD56 Positive Selection Cocktail 各100 μl/mL，在室溫條件下進行孵育，15 min，再于聚苯乙烯試管中分別加入磁珠50 μl/mL，混勻，室溫避光，孵育10 min，再加入Robosep Buffer，至總體積為2.5 ml，放入磁極中5 min，將所需要的DNT細胞倒入新的試管中，重復(fù)3次，加入2 ml Robosep Buffer，1 200 rpm，離心10 min。

1.3.4免疫熒光染色及流式細胞儀檢測 取細胞懸液100 μl，分別加入CD3-PC5/CD4-FITC /CD8-PE，CD3-FITC /CD56-PE各20 μl，室溫避光孵育15 min，加入冷PBS洗滌，1 500 rpm離心，10 min，棄上清，加入0.5 ml的PBS，混勻。采用EPICS-XLII流式細胞儀進行檢測，收集細胞數(shù)5×106個/管。上機前對流式細胞儀進行光流路質(zhì)量調(diào)控，雙色熒光補償，Listmode形式保存文件，應(yīng)用CellQuest軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1DNT細胞的體外培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)第7、10、14天，鏡下可見培養(yǎng)板底大量圓形核深染細胞，細胞數(shù)量及克隆現(xiàn)象逐漸增多，第10天達高峰，第14天可見細胞凋亡現(xiàn)象。

2.2DNT細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果

采用Rosettesep抗體吸附法分離DNT細胞，流式細胞儀檢測CD3+CD4-CD8-T細胞比例為94.4%(圖1)。體外擴增及Easysep免疫磁珠法純化后的CD3+CD4-CD8-T細胞純度可達99.2%(圖 2)。

2.3DNT細胞的體外擴增

將細胞培養(yǎng)至d7，d10，d14，計算擴增倍數(shù)。結(jié)果顯示細胞培養(yǎng)至d10生長最旺盛，延長培養(yǎng)時間，細胞數(shù)逐漸減少。第0天，第4天，第7天，第10天，第14天，DNT細胞數(shù)分別為8×106個，8×107個，3.12×108個，4.24×108個，3.28×108個。DNT細胞擴增倍數(shù)分別為0倍，10倍，39倍，53倍，41倍(圖3)。

3 討論

DNT細胞，是一群既不表達CD4分子，也不表達CD8分子的調(diào)節(jié)性T細胞，通過抗原特定因子的方式，來抑制免疫應(yīng)答的發(fā)生[7]。大量的研究表明，DNT細胞具有抑制腫瘤生長的作用，有望成為一種新型的腫瘤過繼細胞免疫治療方法。目前，一些免疫學(xué)專家認為，能夠使調(diào)節(jié)T細胞活化的刺激因素主要為T細胞受體(TCR)，這種受體對調(diào)節(jié)性T細胞起刺激性作用，對其功能造成影響。但是，DNT細胞與其他種類的調(diào)節(jié)性T細胞不同，因其本身不表達共受體CD4和CD8，也不表達共刺激分子CD28[8]。另外，一些專家學(xué)者指出，細胞因子等對于DNT細胞的激活和DNT細胞發(fā)揮的功能都具有重要的作用[9]。DNT 細胞能夠在體外存活，需要有外源性的IL-2和IL-4的參與刺激，同時IL-4也具有保護DNT細胞的作用，避免發(fā)生和TCR交叉刺激，從而發(fā)生細胞的凋亡[10,11]。有研究者基于體外容易得到的人外周血單個核細胞，用 CD3抗體成功在體外擴增活化T淋巴細胞，并且CD3抗體可增加淋巴細胞轉(zhuǎn)化，并與濃度有關(guān)[12]。

圖3 DNT細胞體外擴增的生長曲線

在實驗研究中我們采用的擴增方法為通過anti-CD3mAb包被培養(yǎng)板，起到了人工APC的作用，能夠減少異體APC所帶來的各種差異，以及異體免疫細胞的污染，減少因異體排斥反應(yīng)所引起的增殖減低，加上rhIL-2和rhIL-4，方法簡便，有利于大批量擴增及應(yīng)用。但此種方法受限于不能長期培養(yǎng)，在培養(yǎng)14天左右細胞數(shù)就逐漸下降，所以本實驗方法有待于進一步改進。Ford Mclntyre等[13]研究發(fā)現(xiàn)，同種異體的APC可以有效的激活DNT細胞，使DNT細胞在體外進行擴增，通過穿孔素途徑可以引起同種異體或同種同體的B細胞的凋亡。在我們的實驗中也同樣見到的細胞凋亡現(xiàn)象，考慮與B細胞的凋亡有關(guān)。

傳統(tǒng)的細胞分選的技術(shù)，如流式細胞術(shù)，十分昂貴，而且對于DNT細胞的分選費時較多， 從而影響了細胞的活性，不利于細胞的進一步培養(yǎng)及應(yīng)用。免疫磁珠法分選細胞是通過磁極和包被不同的抗體，可進行幾乎所有細胞亞群的分離和純化，不僅簡便靈活，而且經(jīng)濟省時，并且對于細胞造成的損傷也小，有利于分離后的培養(yǎng)和應(yīng)用。本實驗采用Rosettesep抗體吸附法和Easysep免疫磁珠法獲得的DNT細胞，純度大于94%，可保證對于DNT細胞體外培養(yǎng)擴增以及對DNT細胞抗腫瘤等作用研究的實驗要求。

通過本研究得到的純度高并且數(shù)量多的DNT細胞，使接下來研究DNT細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能和對腫瘤的抑制作用的分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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AmplificationofHumanperipheralbloodCD3+CD4-CD8-doublenegativeTcellsinvitro

WANGXin-mei,WANGXue-ye,HANMei.

(HematolgyDepartmentofJilinProvincePeople’sHospitalChangchun130021,China)

ObjectiveTo detect the method of isolation and amplification CD3+CD4-CD8-double negative T cells (DNT) in vitro.MethodsWe used the Rosettesep to remove CD4+T cells and CD8+T cells from human peripheral blood.To culture DNT cells with anti-CD3mAb,rhIL-2 and rhIL-4.We computed and recordedthe amplification times after day 10 and day 14.To putify DNT cells with Easysep and test its purity with flow cytometry.ResultsThe purity of DNT cells is 94%.The amplification times is 53 in day 10 and 41 in day 14.ConclusionThe method of Rosettesep and Easysep can be used to isolate and purify DNT cells.

CD3+CD4-CD8-double negative T cells;Rosettesep antibody adsorption method;Easysep micro-magnetic beads method;Flow cytometry

R446.62

A

2016-12-09)

吉林省衛(wèi)生廳項目(2012Z052)，吉林省科技廳項目(20150204074SF)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1831-04

王新梅(1983-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，醫(yī)師，主要從事血液病基礎(chǔ)相關(guān)研究。