王 溪，佟志敏，胡媛媛，金 鵬，李 寧，李詩揚，崔營營,張紅梅

(1.吉林大學第二醫(yī)院 放療科，吉林 長春130041；2.吉林省申邦細胞工程研究所;3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

X線輻射對A549肺腺癌細胞周期和增殖的影響

王 溪1，佟志敏2，胡媛媛1，金 鵬1，李 寧1，李詩揚1，崔營營1,張紅梅3*

(1.吉林大學第二醫(yī)院 放療科，吉林 長春130041；2.吉林省申邦細胞工程研究所;3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

目的探討X線不同放射劑量對A549肺腺癌細胞周期和增殖的影響。方法培養(yǎng)A549肺腺癌細胞，分別用0Gy、0.5Gy、1Gy、1.5Gy、2GyX線照射細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)6 h和12 h后收集細胞，用PI法檢測細胞周期，CCK8法檢測細胞增殖。結果G2期細胞6 h檢測結果顯示，與0Gy組相比，各劑量組G2期細胞比例均顯著增加(P<0.001)，與0.5Gy、1Gy、1.5Gy相比，2Gy組G2期細胞比例也顯著增加(P<0.05)；12 h檢測結果顯示，1Gy、1.5Gy、2Gy組G2期細胞比例均高于0Gy、0.5Gy組(P<0.05)；1.5Gy、2Gy組G2期細胞比例高于1Gy組。S期細胞6 h檢測結果顯示，各劑量組S期細胞比例均高于0Gy組(P<0.05)，但各劑量組之間無明顯差異；12 h檢測結果顯示，各劑量S期細胞比例隨輻射劑量增加而增加，除0Gy組與0.5Gy組、0.5Gy組與2Gy組外均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。6h CCK8結果顯示，與0Gy、0.5Gy組相比2Gy組細胞增殖能力顯著減弱(P<0.05)。12 h CCK8結果顯示，與0Gy、0.5Gy組相比，1Gy、1.5Gy、2Gy組細胞增殖能力顯著減弱(P<0.05)。結論輻射能夠誘導細胞周期阻滯從而抑制細胞增殖，且在一定劑量范圍內呈劑量依賴性。

輻射；細胞周期；增殖

(ChinJLabDiagn,2017,21:1816)

最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌發(fā)病率與死亡率分居世界第二位、第一位[1]，目前肺癌的主要治療方法有化療、放療、靶向治療[2]。放療在肺癌治療中起重要作用，提高腫瘤細胞對放射治療的敏感性，是提高放射治療療效的重要途徑之一，其中放療劑量對腫瘤敏感性起著關鍵的作用[3,4]。惡性腫瘤細胞的過快增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎，細胞周期調控異常是惡性腫瘤的一個基本特征，細胞周期異常是腫瘤細胞惡性增殖的中心環(huán)節(jié)[5-7]，許多抗癌藥物是通過改變腫瘤的細胞周期而實現(xiàn)其抑制腫瘤的作用。放射線可以改變腫瘤細胞周期，電離輻射的細胞毒性取決于細胞周期的分布[8,9]。本研究主要探討了不同X線輻射對A549細胞周期與增殖的影響，為臨床制定放療計劃提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料肺腺癌A549細胞株購自中國科學院上海細胞庫；H-DMEM培養(yǎng)基(GIBCO，美國)；胎牛血清(Biologicallndustries，以色列)；細胞周期與凋亡檢測試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司)；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司)；流式細胞儀EPICS XL(BECKMAN COULTER)；瓦里安直線加速器23 EX(VarianMedicalSystems,Inc)；CO2培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；低溫高速離心機(Thermo，美國)；酶標儀(Gene，美國)。

1.2A549肺腺癌細胞培養(yǎng)無菌工作臺紫外線消毒30 min，將實驗用H-DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清，胰酶，PBS放于37℃的水浴鍋內預熱30 min；在離心管中準備9 ml無血清培養(yǎng)液；液氮罐中取出凍存細胞，放入37℃水浴中輕輕晃動；融化后移至離心管中1 200 rpm離心3 min，小心棄去離心管中上清加入含有10%FBS血清的完全培養(yǎng)基，放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)過夜后更換新鮮的完全培養(yǎng)基。兩天傳代一次，用PBS洗細胞兩次，胰酶消化1 min，用吸管輕輕吹打細胞并將其轉移至離心管中，1 200 rpm離心5 min；棄去離心管中上清，加入含有10%血清的完全培養(yǎng)基懸浮細胞，并分至兩個培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3分組與照射將細胞消化收集并計數(shù)，按每孔2×105/2 ml細胞數(shù)接種于六孔培養(yǎng)板中，于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。根據(jù)照射后培養(yǎng)時間將細胞分為A(照射后培養(yǎng)6 h)、B(照射后培養(yǎng)12 h)兩組，A、B兩組根據(jù)需要照射劑量的不同又分為5組，分別為0Gy組、0.5Gy組、1Gy組、1.5Gy組、2Gy組。

采用劑量率為300 Mu/min、源皮距為100 cm的6MV-X射線對各組細胞對進行照射，照射后立即換液，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4細胞周期檢測分別在培養(yǎng)板的每孔中加PBS，輕輕洗滌細胞，再加0.5 ml 0.25%胰蛋白酶消化細胞，并收集至無菌的1.5 ml EP管中；離心后盡可能棄去EP管中的上清，輕彈管底使管中細胞重懸；按下列比例配制細胞周期緩沖液：1 ml緩沖液、碘化丙啶(PI) 25 μl，RNase A 20 μl。每管分別加入500 μl上述緩沖液；于37℃CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，流式細胞儀檢測。

1.5細胞增殖檢測分別在培養(yǎng)板每孔加入10 μl 7sea-Cell Counting kit，以僅加100 μl完全培養(yǎng)液和7sea-Cell Counting kit作為空白對照；于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值(OD值)。

2 結果

2.1X線不同劑量照射A549肺腺癌細胞后細胞周期的改變

流式細胞檢測結果顯示，A組細胞各劑量組G2期細胞比例隨劑量的增加而增加，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，其中2Gy組與其他各組也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組細胞也顯示出G2期細胞比例隨劑量增加而增加的趨勢(P<0.05)。

A組細胞各劑量組S期比例均高于0Gy組，差異顯著(P<0.05)，而各劑量組之間無明顯變化。

結果表明X線輻射可以引起A549細胞G2期、S期阻滯，且對G2期細胞阻滯呈劑量依賴性(圖1、圖2、圖3)。

2.2不同劑量放療對A、B組A549肺腺癌細胞增殖的影響

CCK8法檢測A549肺腺癌細胞的增殖情況，A組檢測結果顯示：與0Gy組相比，各劑量組的OD值均減小，且隨著照射劑量的增加，OD值越來越小。統(tǒng)計學分析顯示：2Gy組與0Gy、0.5Gy組相比，差異顯著(P<0.05)。B組檢測結果顯示：與0Gy組相比，各劑量組的OD值均減小，且隨著照射劑量的增加，OD值越來越小。統(tǒng)計學分析顯示：與0Gy、0.5Gy組相比，1Gy、1.5Gy、2Gy組OD值均顯著減小(P<0.05)。表明X線輻射可以抑制肺腺癌細胞A549的增殖，且隨劑量的增加，抑制作用越明顯(圖4)。

3 討論

隨著放療技術在醫(yī)學研究領域的進展，輻射對腫瘤細胞的殺傷作用越來越受到人們的重視，本研究以A549細胞為對象，探討了不同輻射劑量對細胞周期和增殖的影響，驗證了在一定范圍內，隨著劑量的增加，X輻射對A549細胞的周期、增殖的抑制作用增強。這為臨床實踐提供了實驗數(shù)據(jù)。

圖1 A、B兩組A549肺腺癌細胞不同劑量輻射后細胞周期檢測結果

圖2 A、B兩組細胞照射后G2期的變化

*：0.5、1.0、1.5、2.0Gy組VS 0Gy組P<0.05；#：1.0、1.5、2.0Gy組VS 0.5Gy組P<0.05

*：0.5、1.0、1.5、2.0Gy組VS 0Gy組P<0.05；#：1.0、1.5、2.0Gy組VS 0.5Gy組P<0.05

細胞周期的正常循環(huán)是細胞增殖的關鍵因素，如果細胞停滯在周期中的某一個時期，則無法進行正常的循環(huán)，從而影響正常的細胞增殖[10-13]。一般的，腫瘤細胞經X線照射后有G2/M 期的阻滯現(xiàn)象，而且G2/M 期的阻滯現(xiàn)象在一定的X線劑量范圍內呈劑量依賴性[9,14]。研究顯示，細胞的放射敏感性與細胞周期、氧效應和DNA損傷修復能力等密切相關。處于不同周期的細胞對射線的敏感性不同。通常，M 期和G2 期的細胞對射線最為敏感，G1 期次之，而S期的細胞最不敏感[15,16]?；谝陨涎芯?，我們對人肺腺癌A549細胞進行不同劑量的X線照射，發(fā)現(xiàn)了X線對A549細胞G2期、S期的抑制作用，而且隨輻射劑量增加，G2期細胞增加越明顯，呈劑量依賴性。我們分別對輻射后6小時、12小時的細胞進行觀察，得到的結論一致，這充分證明了輻射對A549細胞增殖的抑制作用。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer Statistics,2017 [J].CA Cancer J Clin,2017,67(1):7.

[2]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87.

[3]夏 穎，王 葉，薛 蓮，等.MEK 特異性抑制劑U0126 對A549 細胞的放射增敏作用及機制研究 [J].輻射研究與輻射工藝學報，2014,8(4):32.

[4]Dai X,Tao D,Wu H,et al.Low dose hyper-radiosensitivity in human lung cancer cell line A549 and its possible mechanisms[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2009,29(1):101.

[5]陶 丹，程 晶，伍 剛,等.人肺腺癌A549細胞低劑量輻射超敏感性及其機制的研究[J].中華放射醫(yī)學與防護雜志,2009,29(2): 147.

[6]Sak A,Wurm R,Elo B,et al.Increased radiation-induced apoptosis and altered cell cycle progression of human lung cancer cell lines by antisense oligodeoxynucleotides targeting p53 and p21(WAF1/CIP1) [J].Cancer Gene Ther,2003,10(12):926.

[7]Cai Y,Sheng ZY,Liang SX.Radiosensitization effect of overexpression of adenovirus-mediated SIRT6 on A549 non-small cell lung cancer cells [J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(17): 7297.

[8]宋淑軍，左曉勇，徐冰心.X線照射劑量率對A549肺癌細胞周期的影響[J].癌癥進展,2016,10(14):970.

[9]Zhang F,Zhang T,Gu ZP,et al.Enhancement of radiosensitivity by roscovitine pretreatment in human non-small cell lung cancer A549 cells[J].J Radiat Res,2008,49(5): 541.

[10]Tang Y,Luo J,Zhang W,et al.Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis[J].Mol Cell,2006,24(6):827.

[11]Chang HY,Shih MH,Huang HC,et al.Middle infrared radiation induces G2/M cell cycle arrest in A549 lung cancer cells[J].PLoS One,2013,8(1):e54117.

[12]Lin S,Yan Y,Liu Y,et al.Sensitisation of human lung adenocarcinoma A549 cells to radiotherapy by Nimotuzumab is associated with enhanced apoptosis and cell cycle arrest in the G2/M phase[J].Cell Biol Int,2015,39(2):146.

[13]Wakasaya T,Yoshino H,Fukushi Y,et al.A liquid crystal-related compound induces cell cycle arrest at the G2/M phase and apoptosis in the A549 human non-small cell lung cancer cell line[J].Int J Oncol,2013,42(4):1205.

[14]Yang S,Xu J,Shao W,et al.Radiation-Induced Bystander Effects in A549 Cells Exposed to 6 MV X-rays[J].Cell Biochem Biophys,2015,72(3): 877.

[15]Legrys GA,Hall EJ.The oxygen effect and x-ray sensitivity in synchronously dividing cultures of Chinese hamster cells[J].Radiat Res,1969,37(1):161.

[16]Konig K,Baisch H.DNA synthesis and cell cycle progression of synchronized L-cells after irradiation in various phases of the cell cycle[J].Radiat Environ Biophys,1980,18(4):257.

EffectsofX-rayirradiationoncellcycleandproliferationofA549lungadenocarcinomacells

WANGXi,TONGZhi-min,HUYuan-yuan,etal.

(DepartmentofRadiotherapy,SecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveTo investigate the effects of different radiation dosages on cell cycle and proliferation of A549 lung adenocarcinoma.MethodsA549 cells were cultured and then radiation for 0Gy,0.5Gy,1Gy,1.5Gy and 2Gy.The cells were collected after 6h and 12h after irradiation.The cell cycle was detected by PI method,proliferation was detected by CCK8 method.ResultsThe results of 6h showed that compared with 0Gy group,the proportion of G2 phase cells in each dose group was significantly increased (P<0.001).Compared with 0.5Gy,1Gy and 1.5Gy,the ratio of G2 phase cells in 2Gy group was also significantly increased (P<0.05).The results tested in 12 h showed that the ratio of G2 phase cells in 1Gy,1.5Gy and 2Gy groups was higher than that in 0Gy and 0.5Gy group (P<0.05).The ratio of G2 phase cells in 1.5Gy and 2Gy group was higher than that in group 1Gy.The results of 6 h test showed that the proportion of S phase cells in each dose group was higher than that in 0Gy group (P<0.05),but there was no significant difference among the dose groups.The results of 12 h test showed that the proportion of S phase cells ,except for 0Gy group and 0.5Gy group,0.5Gy group and 2Gy group,was increased alone with the increase of dose (P<0.05).The results of 6h CCK8 showed that the proliferation ability of 2Gy group was significantly decreased compared with 0Gy and 0.5Gy group(P<0.05).12 h CCK8 results showed that the cell proliferation ability of 1Gy,1.5Gy,2Gy group was significantly decreased compared with 0Gy and 0.5Gy group(P<0.05).ConclusionRadiation can induce cell cycle arrest and inhibit cell proliferation in a dose-dependent manner.

radiation;cell cycle;proliferation

R734.2

A

2016-11-06)

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20160101104JC)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1816-05