叢 越，王萬梅

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，1.眼底病科；2.心血管內(nèi)科，吉林 長春130041)

維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究

叢 越1，王萬梅2

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，1.眼底病科；2.心血管內(nèi)科，吉林 長春130041)

目的探究維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為干眼病發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。方法5只雄兔維生素A缺乏干眼病模型以及5只正常喂養(yǎng)的雄兔，分別設(shè)為觀察組與對照組。采用原位末端標(biāo)記及免疫組織化學(xué)方法檢測兩組試驗(yàn)動物角膜組織上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況，并檢測FasL、Fas、Bax以及bcl-2等相關(guān)基因蛋白在角膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)，探討維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。結(jié)果觀察組雄兔每高倍鏡視野角膜組織上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量為(4.89±1.34)個，對照組為(0.65±0.32)個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；觀察組每1000個角膜組織上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bax陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量分別為(187.35±23.23)、(212.45±24.55)、(168.67±21.43)個，顯著高于對照組(65.23±18.23)、(68.46±14.51)、(48.43±16.46)個，觀察組每1000個角膜組織上皮細(xì)胞bcl-2陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量為(54.44±16.34)個，顯著低于對照組(217.43±24.13)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Fas、FasL、Bax的表達(dá)與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡呈顯著正相關(guān)(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，bcl-2的表達(dá)與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.754P=0.000)。結(jié)論角膜組織上皮細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致角膜組織上皮細(xì)胞出現(xiàn)干燥、變薄，引起功能減退，導(dǎo)致干眼病癥狀，這可能與Fas、FasL、Bax表達(dá)量增多，bcl-2的表達(dá)量降低加快角膜組織上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。

維生素A缺乏干眼病；角膜組織上皮細(xì)胞；Fas；FasL；Bax；bcl-2；表達(dá)；細(xì)胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:1820)

干眼病是指各種因素引起的淚液動力學(xué)、質(zhì)或量異常，導(dǎo)致降低淚膜穩(wěn)定性，并伴有眼表組織病變以及眼部不適等特征的多種疾病的總稱，臨床上又命名為角結(jié)膜干燥癥。常見癥狀有疲倦、干澀、異物感、眼癢、痛灼熱感、怕風(fēng)、分泌物黏稠、畏光、外界刺激敏感等；眼睛干澀，基本淚液不足，出現(xiàn)反射性淚液分泌引起經(jīng)常流淚，嚴(yán)重者出現(xiàn)眼睛紅腫、充血、角質(zhì)化等，部分可引起角結(jié)膜病變，視力受損[1]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為上皮完整性受損、壞死脫落是干眼病角膜特征性病理變化。近年國外有報道[2]認(rèn)為，干眼病患者角膜上皮細(xì)胞有向小細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢，病情嚴(yán)重者角膜上皮甚至呈角膜上皮結(jié)膜化或鱗狀化，而角膜上皮修復(fù)及愈合過程能夠觀察到細(xì)胞凋亡的存在，F(xiàn)as、FasL、Bax和bcl-2等基因的表達(dá)與細(xì)胞凋亡具有明顯的關(guān)系。因此本實(shí)驗(yàn)通過建立維生素A缺乏的雄兔干眼病模型，探究維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為干眼病的發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

5只雄兔維生素A缺乏干眼病模型，以及5只正常喂養(yǎng)的雄兔，分別設(shè)為觀察組與對照組。觀察組日齡90 d；體重最輕2.45 kg，最重2.57 kg，平均(2.51±0.04)kg；對照組日齡90 d；體重最輕2.49 kg，最重2.65 kg，平均(2.52±0.05)kg；實(shí)驗(yàn)兔均為雄性新西蘭白兔，由我院動物中心飼養(yǎng)，兩組基礎(chǔ)飼養(yǎng)完全相同。比較兩組日齡，體重等一般資料無顯著性差異(P>0.05),具有可比性。

1.2模型建立及標(biāo)本處理

模型建立：兩組基礎(chǔ)飼養(yǎng)完全相同，觀察組雄兔給予完全缺乏維生素A的飼料，對照組正常飼料，每日維生素A攝入量不低于200 μg/kg。所有動物均由一名工作人員檢查，每次檢查地點(diǎn)、時間、光照、濕度及溫度均保持相同。分別飼養(yǎng)90 d后，觀察組毛發(fā)較粗糙，角膜無光澤、干燥，有灰白色潰瘍灶出現(xiàn)。淚液分泌(schirmer)實(shí)驗(yàn)顯示觀察組均<10 mm/5 min，對照組均>20 mm/5 min。觀察組淚膜破裂時間均<12 s，對照組均>24 s，根據(jù)文獻(xiàn)[3]干眼病的診斷標(biāo)準(zhǔn)確定模型建立成功。標(biāo)本處理：飼養(yǎng)90 d后兩組試驗(yàn)兔均采用空氣栓塞法處死，死后立刻取雙眼角膜組織且攜帶1 mm的鞏膜環(huán)，采用40 g/L的多聚甲醛固定，采用常規(guī)石蠟包埋、HE染色。

1.3方法

采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測原位細(xì)胞凋亡情況，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(FITC)購自上海翊圣生物科技有限公司；山羊抗兔Fas、FasL、Bax和bcl-2多抗購自北京索萊寶科技有限公司；過氧化物酶標(biāo)記鏈酶白卵素(SABC)免疫組織化學(xué)試劑盒購自美國R&D公司；3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自上海安妍生物有限公司。標(biāo)本切片后嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行染色，凋亡細(xì)胞原位檢測陽性對照在滴加反應(yīng)液前，于1 g/LDNase I溶液進(jìn)行15 min的室溫孵育；陰性對照組僅添加dUTP-FITC。采用乳腺癌石蠟切片處理免疫組織化學(xué)染色陽性對照，采用PBS液代替一抗處理陰性對照。細(xì)胞凋亡數(shù)統(tǒng)計：隨機(jī)選取兩組5-7個400倍的高倍視野中凋亡細(xì)胞總數(shù)，計算平均值；Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達(dá)：隨機(jī)選取1 000個角膜上皮細(xì)胞，觀察免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞總數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1兩組角膜組織上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量比較

觀察組雄兔每高倍鏡視野角膜組織上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量為(4.89±1.34)個，對照組雄兔為(0.65±0.32)個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組角膜組織上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量比較

2.2兩組角膜組織上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bax、bcl-2陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量比較

觀察組每1000個角膜組織上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bax陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量分別為(187.35±23.23)、(212.45±24.55)、(168.67±21.43)個，顯著高于對照組(65.23±18.23)、(68.46±14.51)、(48.43±16.46)個，觀察組每1000個角膜組織上皮細(xì)胞bcl-2陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量為(54.44±16.34)個，顯著低于對照組(217.43±24.13)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組每1000個角膜組織上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bax、bcl-2陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量比較

2.3Fas、FasL、Bax、bcl-2的表達(dá)與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性

Fas、FasL、Bax的表達(dá)與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡呈顯著正相關(guān)(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，bcl-2的表達(dá)與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.754P=0.000)，見表3。

表3 Fas、FasL、Bax、bcl-2的表達(dá)與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性

3 討論

臨床上認(rèn)為導(dǎo)致干眼病主要有以下原因：(1)長期戴隱形眼鏡、自身免疫疾病引起的淚腺發(fā)炎、眼外傷、自律神經(jīng)失調(diào)、眼部感染、先天性無淚腺以及長期使用眼藥水導(dǎo)致的淚液分泌不足造成的水液層淚腺淚液分泌不足[4]；(2)因眼瞼疾病引發(fā)的瞼板腺功能不良出現(xiàn)油脂層分泌降低[5]；(3)慢性結(jié)膜炎、缺乏維生素A、化學(xué)性灼傷等造成的粘蛋白層分泌降低；(4)因疾病引起的眨眼次數(shù)少、眼瞼閉合不良、長時間停留戶外等導(dǎo)致淚液過度蒸發(fā)出現(xiàn)淚膜分布不均勻[6]。本實(shí)驗(yàn)以不給予維生素A進(jìn)行干眼病家兔模型的建立，維生素A缺乏可直接引起淚腺腺體萎縮、結(jié)膜與角膜上皮干燥而造成干眼病癥狀[7]。本研究觀察組雄兔每高倍鏡視野角膜組織上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證明角膜細(xì)胞凋亡可能作為重要原因影響干眼癥的發(fā)生及發(fā)展。

Fas是神經(jīng)生長因子以及腫瘤壞死因子受體系統(tǒng)家族的一員，有報道[8]證實(shí)無論是Fas表達(dá)于細(xì)胞表面的，還是純化的FasL，只要能夠結(jié)合細(xì)胞表面的Fas分子，使后者出現(xiàn)交聯(lián)情況，能夠?qū)⑿盘杺鬟f到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞便能發(fā)生凋亡[9]。本研究結(jié)果表明，干眼癥兔角膜上皮細(xì)胞Fas蛋白的陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較對照組明顯要高，相關(guān)性分析結(jié)果顯示與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)，表明干眼病患者角膜組織上皮細(xì)胞的凋亡過程可能有Fas參與介導(dǎo)。FasL、Bax的作用與Fas具有相似之處，其表達(dá)量增加也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]，本研究結(jié)果顯示Fas、FasL、Bax的表達(dá)與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡呈顯著正相關(guān)(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，證實(shí)角膜組織上皮細(xì)胞凋亡與Fas、FasL、Bax的高表達(dá)有明顯的相關(guān)性。bcl-2主要在B淋巴瘤中分離得到，對細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，因此我們認(rèn)為正常細(xì)胞中bcl-2基因均處于較高表達(dá)的狀態(tài)，而在凋亡細(xì)胞中其表達(dá)量可能降低，減弱了細(xì)胞凋亡的抑制作用，細(xì)胞凋亡加速[11,12]。本研究結(jié)果顯示觀察組每1000個角膜組織上皮細(xì)胞bcl-2陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組，相關(guān)性分析結(jié)果顯示bcl-2的表達(dá)與角膜組織上皮細(xì)胞凋亡呈顯著負(fù)相關(guān)，這也能有力證明bcl-2基因表達(dá)降低細(xì)胞凋亡加快的理論[13]。

雖然目前尚未完全對干眼病的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行確切的判定，但認(rèn)為其與角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡有明顯的關(guān)系。細(xì)胞凋亡參與干眼癥發(fā)病機(jī)制可能有以下兩個原因：(1)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致淚腺和結(jié)膜杯狀細(xì)胞受到影響，引起角膜上皮結(jié)膜化或鱗狀化[14]；(2)細(xì)胞凋亡對炎癥細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的影響，炎癥細(xì)胞分泌細(xì)胞因子對淚液分泌反射的正常神經(jīng)聯(lián)系產(chǎn)生影響，進(jìn)而使淚腺的神經(jīng)支配降低，使淚腺腺泡的萎縮加重[15]。

綜上所述，角膜組織上皮細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致角膜組織上皮細(xì)胞出現(xiàn)干燥、變薄，引起功能減退，導(dǎo)致干眼病癥狀，這可能與Fas、FasL、Bax表達(dá)量增多，bcl-2的表達(dá)量降低加快角膜組織上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[1]高 虹,叢 琦,全成實(shí),等.甲狀腺癌組織中凋亡相關(guān)蛋白Fas,FasL,Bcl-2和Bax的表達(dá)及意義[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,2005,19(4):273.

[2]Li C P,Li J H,He S Y,et al.Roles of Fas/Fasl,Bcl-2/Bax,and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis[J].Genetics & Molecular Research Gmr,2014,13(2):3991.

[3]馬軼群,王傳富,劉美光.去勢雄兔干眼病模型角膜上皮細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志,2004,22(3):286.

[4]雷紅宇,袁 慧,鄔 靜,等.圓弧青霉菌毒素-青霉酸對小鼠脾臟組織細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Bax及Fas/FasL基因mRNA表達(dá)的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2011,31(1):81.

[5]He P,Zhou G,Qu D,et al.HBx inhibits proliferation and induces apoptosis via Fas/FasL upregulation in rat renal tubular epithelial cells.[J].Journal of Nephrology,2013,26(6):1033.

[6]舒小林.AsO對大鼠生精細(xì)胞凋亡及其Bcl-2、Bax和Fas、FasL調(diào)控途徑影響的研究[D].遵義醫(yī)學(xué)院,2008.

[7]查文章,吳 穎,范仁根.Fas/FasL、Bax及Bcl-2在1型糖尿病大鼠中的表達(dá)及其與凋亡的關(guān)系[J].蘇州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2009,29(4):621.

[8]張列轉(zhuǎn).自然流產(chǎn)小鼠胎盤細(xì)胞凋亡及其相關(guān)調(diào)控基因Fas/FasL,Bcl-2/Bax的表達(dá)[D].山西醫(yī)科大學(xué),2007.

[9]Li C L,Chang L,Guo L,et al.β-elemene induces caspase-dependent apoptosis in human glioma cells in vitro through the upregulation of Bax and Fas/ FasL and downregulation of Bcl-2[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention,2014,15(23):10407.

[10]張德江.凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Fas、FasL在乳腺癌中的表達(dá)及其相互關(guān)系的研究[D].安徽醫(yī)科大學(xué),2000.

[11]茍春風(fēng),李 麗,劉 勤,等.輔酶Q(10)對大鼠紫外線光損傷角膜上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].中華眼外傷職業(yè)眼病雜志,2008,30(8):597.

[12]張雅萍.橋本氏甲狀腺炎中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL、Bcl-2和Bax表達(dá)的免疫組織化學(xué) 研究[D].第四軍醫(yī)大學(xué),1999.

[13]毛 靜，王麗麗，李 亞，等.補(bǔ)肺健脾方對COPD大鼠骨骼肌Fas、FasL、Bcl-2及Bax表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2017，32(2)：746.

[14]吳 軍,唐福林.干燥綜合征淚腺組織中細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的研究[J].中華眼科雜志,2000,36(4):255.

[15]宋興福,袁紅綱,陳先國.佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜組織凋亡因子Fas/FasL及Bcl-2/Bax表達(dá)與青蒿琥酯的干預(yù)(英文)[J].中國組織工程研究,2007,11(36):7306.

RelationshipbetweenFas,FasL,Baxandbcl-2expressionindryeyecornealepithelialcellsinducedbyvitaminAdeficiencyandapoptosis

CONGYue,WANGWan-mei.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of Fas,FasL,Bax and Bcl-2 in dry eye corneal epithelial cells induced by vitamin A deficiency and apoptosis,and to provide the theoretical basis for the study of the pathogenesis of dry eye.MethodsThe experimental subjects were 5 male rabbits model with dry eye induced by vitamin A deficiency,and 5 normal feeding male rabbits,rabbits were respectively set as the observation group and the control group.The corneal epithelial cells apoptosis was surveyed by in situ end-labeling (ISEL) and immunohistochemistry method,followed by FasL,Fas,Bax,bcl-2 and other related gene protein expression in corneal epithelial cells to primarily explore the relationship between Fas,FasL,Bax and bcl-2 expression in dry eye corneal epithelial cells induced by vitamin A deficiency and apoptosis.ResultsThe corneal epithelial cells count of the observation group per high-power field of view was (4.89±1.34),while the control group was (0.65±0.32),the difference had statistical significance (P<0.05);The observation group’s Fas,FasL,Bax positive cells expression number per 1000 corneal epithelial cell were (187.35±23.23),(212.45±24.55),(168.67±21.43),which was sharply higher than those of the control group (65.23±18.23),(68.46±14.51),(48.43 ±16.46).The observation group’s Bcl-2 positive cells expression amount per 1000 corneal epithelial cells was (54.44±16.34),which was evidently lower than that of the control group (217.43±24.13) ,the difference showed statistical meaning (P<0.05);A positive correlation was found between Fas,FasL,Bax expression and apoptosis of corneal epithelial cells(r=0.675,r=0.785,r=0.678,P=0.000),bcl-2 expression was negatively related to the apoptosis of corneal epithelial cells(r=-0.754,P=0.000).ConclusionThe apoptosis of corneal tissue epithelial cells may lead to dry,thinning,hypofunction,dry eye symptoms,which may be related to the increase of Fas,FasL,Bax expression and corneal tissue epithelial cells apoptosis acceleration caused by bcl-2 expression decrease.

dry eye induced by vitamin A deficiency;corneal epithelial cells;Fas;FasL;Bax;Bcl-2;expression;apoptosis

R772.2

A

2016-12-30)

1007-4287(2017)10-1820-04