張進(jìn)，李穎，范潔

(云南省第一人民醫(yī)院 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650000)

研究報(bào)告

miR-5572轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建病態(tài)竇房結(jié)綜合征疾病模型的繁殖與鑒定

張進(jìn)，李穎，范潔*

(云南省第一人民醫(yī)院 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650000)

目的探討miR-5572轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建病態(tài)竇房結(jié)綜合征疾病模型的可行性。方法繁殖與鑒定了 miR-5572 F1及F2代野生型純合子及雜合子小鼠，并通過形態(tài)學(xué)、心電圖記錄及竇房結(jié)組織Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平測(cè)定來觀察疾病模型。結(jié)果F2代miR-5572純合子敲入小鼠在形態(tài)上較野生型小鼠生長(zhǎng)緩慢，體型較小。相較于雜合子和野生型小鼠，純合小鼠的平均心率明顯偏低(P<0.05)，差異有顯著性。miR-5572純合子小鼠竇房結(jié)組織Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平低于野生型(P<0.05)，差異有顯著性。結(jié)論過表達(dá)miR-5572轉(zhuǎn)基因小鼠可以構(gòu)建病態(tài)竇房結(jié)綜合征疾病模型。

病態(tài)竇房結(jié)綜合征；轉(zhuǎn)基因小鼠；繁殖與鑒定；微小RNA-5572

病態(tài)竇房結(jié)綜合征 (sick sinus syndrome, SSS)是由于竇房結(jié)及其周圍組織的器質(zhì)性改變導(dǎo)致心臟竇房結(jié)起搏功能障礙, 從而引起緩慢心律失常的綜合征。近幾年研究表明，SSS的發(fā)病與離子通道如Cav1.3、Cav1.2、Nav1.5、Cav3.1和Cav3.2異常表達(dá)有關(guān)[1-6]。

MicroRNAs是長(zhǎng)度為20-25 nt的短鏈非編碼RNAs，其發(fā)揮生物功能的主要方式是：與mRNAs互補(bǔ)或者非互補(bǔ)方式結(jié)合，從而阻斷蛋白翻譯過程，使靶基因表達(dá)下調(diào)[7]。通過課題組前期的人血漿及動(dòng)物心肌組織表達(dá)譜芯片以及熒光定量PCR技術(shù)，我們最終篩選出人血漿及動(dòng)物心肌組織中差異表達(dá)比較明顯的miR-5572。并且通過目前權(quán)威的MicroRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda，miRBase，TargetScan[8,9]預(yù)測(cè)miR-5572的靶基因?yàn)镃av1.2、Cav1.3，而Cav1.2、Cav1.3與SSS的發(fā)病密切相關(guān)[1-6]。因此，我們從賽業(yè)生物科技有限公司購入了12只F1代miR-5572過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)，以期驗(yàn)證miR-5572轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建病態(tài)竇房結(jié)綜合征疾病模型的可行性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡C57BL/6 miR-5572陽性 F1代小鼠12只，購自賽業(yè)生物科技有限公司【SCXK (滇) K 2015-0005】。其中：雄性7只，平均體重(25.0±1.2)g，雌性5只，平均體重(24.2±1.0)g。小鼠在昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行繁殖【SYXK(滇) K2015-0002】。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

C57BL/6 miR-5572 F1代雜合子小鼠同胞之間相互雜交獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的F2代野生型，純合子及雜合子小鼠(繁殖示意圖見：圖2A, B)，每種小鼠獲得6只后分為三組進(jìn)行心電圖的記錄，野生型(6只)，雜合子(6只)，純合子(6只)。

1.2主要試劑及儀器

心電圖儀(EickECG-220X)，異氟烷麻醉劑，DNA提取試劑盒:TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit (Ver.5.0_Code No.9765),引物由生工生物工程股份有限公司合成，瓊脂糖 (BIOWEST)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取及鑒定

對(duì)小鼠尾和腳趾使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit (Ver.5.0_Code No.9765)試劑盒進(jìn)行DNA的提取，將得到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，使用Thermo Scientific GeneRuler 100 bp DNA Ladder，進(jìn)行小鼠的基因型鑒定。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因小鼠心電圖記錄

對(duì)已成年的野生型，純合子，雜合子小鼠采用異氟烷麻醉劑進(jìn)行吸入式麻醉，并采用肢體導(dǎo)聯(lián)的方法進(jìn)行心電圖的記錄。電極位置參照人的相應(yīng)部位，心電圖機(jī)走紙速度 25 mm/s。(見圖1)

圖1 轉(zhuǎn)基因小鼠平均心率的記錄Fig.1 The recording device of the average heart rate of the miR-5572 transgenic mice

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)

用Qiagen試劑盒提取純合子、雜合子及野生型小鼠竇房結(jié)組織總RNA。采用SYBR法在Real-time-PCR 7900儀上行定量 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA 1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，SYBR 5 μL、水3 μL，反應(yīng)條件：95℃ 1 min→ 95℃ 15 s→ 60℃ 60 s→ 95℃ 15 s→ 60℃ 15 s→ 95℃ 15 min。第2～4步35～40個(gè)循環(huán)，以 GAPDH 為內(nèi)參，利 用TaKara-PrimeScriptTMII 1st strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?，利?2-ΔΔCt方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

取純合子、雜合子及野生型小鼠竇房結(jié)組織，提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。取相同量總蛋白行SDS-PAGE電泳，80 V電壓20～30 min，120 V電壓約90 min。300 mA濕轉(zhuǎn)印120 min，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，根據(jù)需要加入一抗(Cav1.2及Cav1.3，購于Abcam公司)。4℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，根據(jù)一抗加入相應(yīng)的二抗，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液在ChemiDocTMXRS+ System (Bio-Rad)顯影，用Image 軟件曝光加灰度值分析。

1.4交配原則

其一：通過TALEN技術(shù)[10 ]將目的基因隨機(jī)整合到基因組，因此首代轉(zhuǎn)基因小鼠(F0)的每一只的整合位點(diǎn)都可能會(huì)不同，后代的基因型也可能不一樣。因此，每一只F0代小鼠都需要作為一個(gè)單獨(dú)的譜系，與不同的F0代小鼠分開進(jìn)行繁殖。其二：由于外源基因一般只在二倍體動(dòng)物的一條染色體上進(jìn)行整合，且F0之間不能相互交配。因此，F(xiàn)0代要與背景相同的野生型小鼠進(jìn)行交配，篩選出基因型一致的F1代，以保證其遺傳背景的純合性。

1.5交配流程

F0代小鼠性成熟后(8周)與野生型小鼠進(jìn)行交配繁殖，獲得F1代小鼠。將來自同一只F0的陽性F1代小鼠同胞交配，可獲得F2代小鼠。

1.6選種原則及注意事項(xiàng)

選擇發(fā)育良好、體形正常、體毛光滑、體格健壯、食欲旺盛、反應(yīng)敏捷、眼睛明亮有神、尾不彎曲、均勻、無異常、無皮膚病、生殖器正常的小鼠用于繁殖的動(dòng)物留種。一般選擇陽性后代中雌性小鼠作為留種對(duì)象，雄性可以作為擴(kuò)大繁殖用。主要采用1∶2或1∶3的長(zhǎng)期同居法進(jìn)行交配。并詳細(xì)記錄小鼠的繁育情況，以便于對(duì)小鼠的繁育情況進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與整理，為每只小鼠建立終身的籠卡和個(gè)體系譜作為資料長(zhǎng)期保存。對(duì)于新出生小鼠應(yīng)避免挪動(dòng)，而幼鼠一般在3周左右進(jìn)行斷乳，若出現(xiàn)發(fā)育緩慢的小鼠，斷乳時(shí)間可延長(zhǎng)至30 d左右。

1.7小鼠的標(biāo)記方法

實(shí)驗(yàn)本著不對(duì)動(dòng)物生理或?qū)嶒?yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，以及耐久適用的原則進(jìn)行標(biāo)記。在幼鼠出生7 d左右，可以采用斷趾方法，對(duì)幼鼠進(jìn)行獨(dú)立編號(hào)，同時(shí)，采用剪尾方法獲取組織進(jìn)行鑒定。小鼠的剪尾長(zhǎng)度約3 mm，剪下后放入EP管中，寫明腳趾編號(hào)和性別。幼鼠在21～28 d進(jìn)行分籠，雌雄分開放到不同籠盒中且每個(gè)籠盒不超過5只小鼠。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1F2代轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得

通過同窩F1 代雜合子小鼠的互交獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要的F2代小鼠(圖2A, B)，F(xiàn)2代小鼠中純合子，雜合子及野生型小鼠比例符合孟德爾遺傳規(guī)律(圖3，3A,3B)，提示miR-5572轉(zhuǎn)基因小鼠傳代過程中未發(fā)生突變。

注：A: F0代雜合小鼠和同類型野生型小鼠交配獲得F1代小鼠；B：F1代雜合子小鼠互交獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要的F2代轉(zhuǎn)基因小鼠。圖2 獲得F2代轉(zhuǎn)基因小鼠示意圖Note. A: Diagram of the harvested F1 miR-5572 heterozygous mice; B: Diagram of the harvested F2 miR-5572 homozygous mice. Tg：Trangenic; +：Wild type.Fig.2 Diagram of harvested F2 miR-5572 transgenic mice

2.2miR-5572純合小鼠和野生小鼠發(fā)育情況對(duì)比

6月齡時(shí)，將miR-5572純合小鼠和野生型、雜合小鼠進(jìn)行發(fā)育情況比較，大體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，miR-5572純合小鼠體型較短，發(fā)育相對(duì)遲緩(見圖4)。6月齡時(shí)，純合小鼠平均體重為：(25.2±2.8)g，雜合子小鼠平均體重為：(31.7±2.1)g，野生型小鼠平均體重為：(32.4±3.7)g。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：純合小鼠平均體重與雜合子小鼠及野生型小鼠平均體重差異有顯著性(P<0.05)。雜合子小鼠及野生型小鼠平均體重差異無顯著性。

注：A: 1～5號(hào)為野生型小鼠；6～9號(hào)為純合小鼠；10號(hào)為雜合子小鼠。B: 2、3、13號(hào)，表示基因純和小鼠；1、4～6、9～12、16號(hào)，表示雜合小鼠；7、8、14、15號(hào)表示野生型小鼠。M表示DNA marker。圖3 F2代轉(zhuǎn)基因小鼠的電泳圖Note. A: 1-5 represent wild-type mice; 6-9 represent homozygous mice; 10 represent heterozygous mice．B: 2,3,13 represent homozygous mice; 7, 8, 14, 15 represent wild-type mice;1,4-6,9-12,16 represent heterozygote mice．Fig.3 Identification of the F2 miR-5572 transgenic mice by PCR.

圖4 純合子、雜合子和野生型小鼠6月齡時(shí)的生長(zhǎng)情況Fig.4 Development of the homozygous, heterozygous and wild type mice at 6 months of age

2.3純合小鼠、雜合小鼠和野生型小鼠6個(gè)月時(shí)的心電圖差異

6月齡時(shí)，在異氟烷吸入麻醉下記錄小鼠肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，純合小鼠、雜合小鼠和野生型小鼠各6只，取平均值，結(jié)果提示：純合小鼠、雜合小鼠和野生型小鼠的平均心率分別為260，375和428次/分。純合子小鼠的平均心率較雜合子及野生型小鼠平均心率顯著下降，且差異有顯著性，其他心電學(xué)指標(biāo)：PR間期，QTc間期，QRS間期未見差異顯著性。見圖5，表1。

2.4純合小鼠，雜合小鼠和野生型小鼠6個(gè)月時(shí)竇房結(jié)組織Cav1.2、Cav1.3mRNA和蛋白表達(dá)水平測(cè)定

我們?nèi)〖兒闲∈?，雜合小鼠和野生型小鼠竇房結(jié)組織進(jìn)行Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平測(cè)定，qRT-PCR顯示：純合小鼠及雜合子小鼠竇房結(jié)組織Cav1.2、Cav1.3 mRNA表達(dá)明顯低于野生型小鼠P<0.05，n=6)。免疫印跡結(jié)果顯示相似的結(jié)果(圖6)。

表1 純合小鼠，雜合小鼠和野生型小鼠平均心率、PR間期，QTc間期，QRS間期的比較Tab.1 Comparison of average heart rate, PR interval, QTc interval, QRS interval in the wild type, heterozygous and homozygous mice

注：*表示純合子小鼠組與野生型小鼠組比較P<0.05，△表示純合子組與雜合子組比較P<0.05。

Note.*indicates the comparison between homozygous and the wild type mice,P<0.05;△indicates the comparison between homozygous and heterozygous mice,P<0.05.

注：野生型、雜合子及純合子小鼠的平均心率分別為428、375和260 次/分。圖5 miR-5572野生型小鼠(A)、雜合子小鼠(B)及純合子小鼠(C)心電圖Note. The average heart rate was 428 beat per minute (bpm) (A), 375 bpm (B), 260 bpm (C) in the wild type, heterozygote and homozygous mice, respectively.Fig.5 Electrocardiograms (ECG) of the wild type (A), heterozygous (B) and homozygous (C) mice

圖6 純合小鼠、雜合小鼠和野生型小鼠竇房結(jié)組織Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平測(cè)定Fig.6 The Cav1.2 and Cav1.3 expression at mRNA and protein levels in sinoatrial node tissue of the homozygous (HO), heterozygous (HE) and wild type mice (WT)

3 討論

隨著老齡化社會(huì)的到來及心血管疾病的逐年增多，SSS病人數(shù)量逐年增加，針對(duì)這一疾病的主要診斷方法是心電圖，而多數(shù)病人確診后安裝人工心臟起搏器仍是主要的治療方法，但是人工心臟起搏器治療存在一些先天的缺陷和不足，如起搏器昂貴的價(jià)格、電池壽命有限、心內(nèi)電極植入存在風(fēng)險(xiǎn)等[11]。因此，建立SSS動(dòng)物疾病動(dòng)物模型對(duì)探索其發(fā)病機(jī)制及改善治療具有重要意義。目前國內(nèi)外尚未見較好的SSS動(dòng)物疾病模型,國內(nèi)報(bào)道用甲醛或者氫氧化鈉涂抹竇房結(jié)致兔竇房結(jié)損傷建立SSS疾病動(dòng)物模型[12,13]，但該方法需開胸屬于有創(chuàng)性方法，動(dòng)物損傷程度較大，損傷程度難以把握，動(dòng)物容易死亡，且該方法不能模擬竇房結(jié)組織的自然老化及病變過程。因此迫切需要建議一種損傷小，能夠模擬自然狀態(tài)下SSS發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)物模型。

近年來，逐漸闡述了L型Ca2+通道功能的喪失或減弱可能是SSS的發(fā)病機(jī)制。例如，Cav1.3介導(dǎo)的L型Ca2 +(ICa，L)電流中的功能喪失可導(dǎo)致竇房結(jié)功能障礙[1,2]。此外，有數(shù)據(jù)表明，慢性鐵過載通過Cav1.3介導(dǎo)的L 型鈣電流的減少誘導(dǎo)獲得性SSS[3]。在小鼠中，Cav1.3通道可在竇房結(jié)，心房和房室結(jié)中表達(dá)，而缺乏Cav1.3通道的小鼠的心率出現(xiàn)了心動(dòng)過緩等一系列SSS癥狀[4,5]。Jones研究表明， 豚鼠竇房結(jié)中心Cav1.2缺失面積隨著年齡的增加而增加，這種缺失可能有助于解釋隨著年齡的增加出現(xiàn)的固有心率下降和竇房結(jié)傳導(dǎo)減慢[6]。以上這些研究得出了重要結(jié)論：即Cav1.3及Cav1.2的缺失或者減少可能是SSS發(fā)病的重要離子通道機(jī)制。但Cav1.3及Cav1.2的缺失或者減少的轉(zhuǎn)錄機(jī)制目前還不清楚。近幾年來發(fā)現(xiàn)高等真核細(xì)胞中廣泛存在一種內(nèi)源性的、非編碼的、長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的單鏈RNA,并命名為MicroRNA(簡(jiǎn)寫為miRNA)。miRNA通過與靶基因mRNA 的3′ 非翻譯區(qū)(3′-UTR) 不同程度的互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致靶基因的降解或抑制,從而在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。每種miRNA可調(diào)控多種靶基因mRNA，一種靶基因mRNA可能受不同miRNA的調(diào)控[7]。miRNA的這種多靶標(biāo)性使其作為重要的調(diào)節(jié)分子廣泛參與了幾乎所有的生理和病理過程。因此，在各種病理因素下，表達(dá)異常的miRNA有可能多靶點(diǎn)、負(fù)向調(diào)控起搏相關(guān)基因Cav1.3及Cav1.2并導(dǎo)致不利的竇房結(jié)離子通道重塑，從而導(dǎo)致SSS發(fā)生、發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)通過前期的表達(dá)譜芯片以及熒光定量PCR技術(shù)，從中挑選出一個(gè)差異表達(dá)比較明顯的miR-5572進(jìn)行驗(yàn)證。miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda，miRBase，TargetScan[8,9]預(yù)測(cè)miR-5572的靶基因?yàn)镃av1.2、Cav1.3，而Cav1.2、Cav1.3編碼的離子通道蛋白與SSS的發(fā)病密切相關(guān)[1-6]，提示miR-5572轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建病態(tài)竇房結(jié)綜合征疾病模型的可行性。我們通過賽業(yè)公司構(gòu)建了miR-5572轉(zhuǎn)基因小鼠，通過繁殖和鑒定了F0、F1、F2代小鼠。通過對(duì)比6個(gè)月時(shí)純合子，雜合子和野生型小鼠的生長(zhǎng)情況，以及心電圖的比較，我們可以發(fā)現(xiàn)，miR-5572純合子敲入小鼠在形態(tài)上較野生型小鼠生長(zhǎng)緩慢，且體形較小。在平均心率方面，純合小鼠，雜合小鼠和野生型小鼠的平均心率分別為260、375和428分/次，相較于雜合子和野生型小鼠，純合小鼠的心率明顯偏低。這些表型提示：過表達(dá)的miR-5572有可能下調(diào)靶基因Cav1.2，Cav1.3的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而導(dǎo)致竇房結(jié)功能減退，最終引起動(dòng)物發(fā)育遲緩及平均心率降低，我們進(jìn)一步研究結(jié)果同時(shí)提示：miR-5572純合小鼠竇房結(jié)組織Cav1.2、Cav1.3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于雜合子小鼠及野生型小鼠，過表達(dá)miR-5572可以負(fù)向調(diào)小鼠竇房結(jié)組織Cav1.2、Cav1.3 mRNA及蛋白表達(dá)，從而調(diào)控起搏電流的產(chǎn)生及平均心率的減慢，提示動(dòng)物過表達(dá)miR-5572可以構(gòu)建病態(tài)竇房結(jié)綜合征疾病模型，這為進(jìn)一步研究病態(tài)竇房結(jié)綜合征的發(fā)病機(jī)制及可能的治療靶點(diǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。

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BreedingandgenotypingofamiR-5572transgenicmousemodelofsicksinussyndrome

ZHANG Jin, LI Ying, FAN Jie*

(The First People’s Hospital of Yunnan Province，The Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology，Department of Cardiology, Kunming 650000, Yunnan, China)

ObjectiveThis study aimed to explore the possibility of establishing a model of sick sinus syndrome by using miR-5572 transgenic mice.MethodsF1 and F2 miR-5572 transgenic mice were bred and genotyped, and then observed the phenotype levels of miR-5572 transgenic mice by morphology, electrocardiogram record (ECG) and the Cav1.2 and Cav1.3 expressions levels of mRNA and protein in sinoatrial node tissue of homozygous, heterozygote and wild type mice.ResultsCompared with the wild type and heterozygous mice,the miR-5572 homozygous mice showed a development delay and smaller body shape,and had slower average heart rate.The mRNA and protein levels of Cav1.2 and Cav1.3 in the sinoatrial node tissues were significantly lower.ConclusionsThe results of this study indicate that miR-5572 homozygous mice may be an efficient approach to establish the model of sick sinus syndrome

Sick sinus syndrome; Transgenic mice; Breeding and genotyping; miR-5572

FAN Jie. Email: fanj913@sina.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0467-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.001

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360039,81260038)；云南省心律失常診治研究中心基金(No.2014NS260, 2014NS259)。

張進(jìn)(1976-)，男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樾募〖?xì)胞及電生理。Email: zhaqngjinxy@sina.com

范潔(1964-)，女，主任醫(yī)師，主要從事心律失常及心電生理研究。Email: fanj913@sina.com