曹永芝，趙躍然，林德貴

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 北京 100193； 2. 山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心，濟(jì)南 250021)

研究報告

PCOS易感基因Hmga2在小鼠子宮蛻膜化中的表達(dá)與調(diào)節(jié)

曹永芝1,2，趙躍然2，林德貴1*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 北京 100193； 2. 山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心，濟(jì)南 250021)

目的研究PCOS易感基因Hmga2在子宮內(nèi)膜容受性和蛻膜化中的表達(dá)與調(diào)節(jié)。方法通過早期妊娠、延期著床與激活、人工蛻膜化、卵巢類固醇激素處理等實驗，利用qPCR、Western blot技術(shù)，闡述Hmga2在子宮內(nèi)膜容受性中的作用。結(jié)果Hmga2隨著妊娠表達(dá)量逐漸增加，著床點與非著床點相比表達(dá)量顯著升高，胚胎激活組比延遲著床表達(dá)量顯著增高，人工誘導(dǎo)蛻膜化與非蛻膜化比較表達(dá)顯著升高，Hmga2的表達(dá)與雌激素和孕激素呈正相關(guān)，體內(nèi)受雌孕激素調(diào)節(jié)。結(jié)論表明Hmga2的表達(dá)與小鼠早期妊娠胚胎著床過程密切相關(guān)，參與子宮內(nèi)膜蛻膜化過程，受活化胚泡和類固醇激素的影響。

多囊卵巢綜合征；高遷移率族蛋白A2；蛻膜化；胚胎；小鼠

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一個表型復(fù)雜多樣以及表現(xiàn)高度異質(zhì)性的常見女性內(nèi)分泌疾病。其主要的臨床表現(xiàn)為月經(jīng)不規(guī)律(月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng))，高雄激素表現(xiàn)(臨床高雄激素表現(xiàn)和/或高雄激素血癥)以及卵巢多囊性改變[1]。研究報道，6%～8%的生育期女性被診斷為PCOS[2]。PCOS發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，至今仍未完全闡明，一般認(rèn)為由遺傳和環(huán)境兩方面共同影響，與下丘腦-垂體-卵巢軸功能失常、腎上腺功能紊亂、遺傳、代謝、環(huán)境等因素有關(guān)。妊娠過程的成功有賴于兩個方面：一是優(yōu)質(zhì)的胚胎，二是良好的子宮內(nèi)膜容受性，此二者在各種因素的嚴(yán)格調(diào)控下相互作用，完成胚胎著床過程。排卵后的6～10 d，月經(jīng)周期的20～24 d子宮有個極短的允許胚胎植入容受性最大的敏感期，妊娠期間的這個特定的時間間隔被定義為胚胎植入的窗口期(window of implantation, WOI)[3]，部分PCOS患者接受促排卵治療后觀察到存在高排卵率、低妊娠率的現(xiàn)象，受精卵植入過程發(fā)生的障礙是這種治療后妊娠失敗現(xiàn)象的主要原因，其發(fā)生的關(guān)鍵在于子宮內(nèi)膜容受性降低[4，5]，子宮內(nèi)膜容受性對提高PCOS患者妊娠率有重要作用。

囊胚粘附到子宮上皮后，圍繞囊胚子宮基質(zhì)細(xì)胞開始發(fā)生廣泛地增殖和分化，同時伴隨著蛻膜區(qū)大量的血管發(fā)生，這個過程稱為子宮蛻膜化。植入位點處的子宮體積和重量迅速地増大，最終使胚泡完全包埋入子宮系膜對側(cè)的基質(zhì)床中[6]。目前認(rèn)為蛻膜的主要作用是在有功能的胎盤形成之前為胚泡的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，并且早期蛻膜對發(fā)育初期的胚胎起到免疫保護(hù)作用[6,7]。

在胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞分化主要依賴特定基因通過特定的方式進(jìn)行調(diào)控。核染色體的結(jié)構(gòu)變化對于基因的啟動和表達(dá)起著決定性作用。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，GWAS)中高遷移率族蛋白A2(HMGA2)基因為PCOS 易感基因，該基因是近年發(fā)現(xiàn)的染色質(zhì)非組蛋白，它能通過與染色質(zhì)結(jié)合而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄。人類的HMGA2編碼基因長度約為160 kb，其編碼序列中共包含5個外顯子[8-10]。Hmga2-/-的小鼠表現(xiàn)為侏儒表形，且因缺乏精子生成能力而不育，而突變型Hmga2過表達(dá)，則導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)體型巨大、肥胖及發(fā)生淋巴瘤[11]。研究表明HMGA2在多種惡性抑瘤組織中存在過表達(dá)現(xiàn)象，且與其不良預(yù)后有關(guān)[12,13]，在卵巢漿液性癌中，HMGA2可作為其早期診斷的分子標(biāo)志物，與P53聯(lián)合應(yīng)用提高診斷效率[14,15]。

HMGA2在GWAS驗證研究中已經(jīng)確定為PCOS易感基因，該基因在PCOS病人胚胎著床過程中的作用未見報道。因此，本研究擬通過體內(nèi)動物模型研究Hmga2在子宮內(nèi)膜容受性和蛻膜化中的作用，評價胚胎植入窗口期子宮內(nèi)膜容受性的高低，對于提高IVF妊娠率和尋求有效的避孕措施有一定的臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，6～8周齡，體重約為 22～24 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供【SCXK(魯)2013-0009】，飼養(yǎng)于22℃恒溫條件下，光照周期為 14 h 光照(06:00-20:00)，10 h 黑暗，自由采食和飲水。實驗小鼠飼養(yǎng)及組織取材均于山東大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行【SYXK(魯)2010-0011】。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.1.2 試劑

檢測 RNA 提取試劑盒和 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司，mRNA定量試劑采用LightCycler? 480 SYBR green I master，儀器采用Light Cycler?96 熒光定量 PCR 儀(Roche)。Western blot所用一抗為anti-HMGA2 antibody(GT763)，二抗(抗鼠，Proteintech, goat anti-mouse IgG(H+L)，SA00001-1)，內(nèi)參選用anti-β-actin(Proteintech, 60008-1-Ig)，RIPA蛋白裂解液等其他試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1 實時熒光定量PCR分析

采用Trizol Reagent 抽提子宮組織RNA，異丙醇沉淀濃縮 RNA，滅菌 DEPC 水溶解總 RNA，紫外分光光度計測總 RNA 的吸光度(absorbance，A)值，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以cDNA 為模板檢測Hmga2和GAPDH的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參照計算Hmga2的相對表達(dá)量。Hmga2的引物序列為:上游5′-AAGGCAGCAAAAACAAGAGC-3′，下游5′-GCAGGCTTCTTCTGAACGAC- 3′；GAPDH的引物序列為: 上游5′-TCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游5′-GCCAAATTCGTTGTCATACC -3′，引物由上海英駿科技有限公司合成。PCR循環(huán)條件為 94℃預(yù)變性 3 min、94℃變性20 s、63℃退火 20 s、72℃延伸30 s，共30個循環(huán)。PCR 反應(yīng)的特異性通過產(chǎn)物熱解離曲線進(jìn)行確認(rèn)逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，運用qRT-PCR 檢測。

1.2.2 Western Blot分析

用細(xì)胞裂解液提取組織總蛋白，用 BCA 蛋白定量法測定總蛋白濃度。配制分離膠(14%)和濃縮膠(5%)；60 V 恒壓預(yù)電泳 1 h 后上樣，80 V 恒壓電泳；待充分分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上；5%脫脂奶粉封閉 1 h 后，一抗(anti-HMGA2 antibody: Abcam，GT763, 1∶1000稀釋；anti-β-actin，Proteintech, 60008 -1-Ig，1∶2000稀釋)4℃過夜；PBST 清洗 3 次，每次5 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育(Proteintech，goat anti-mouse IgG(H+L)，SA00001-1，1∶5000稀釋)1 h 后，PBST 清洗 3 次，每次5 min；ECL 法顯色。

1.2.3 動物模型及取材

(1)早期妊娠

注：A: Hmga2 mRNA 在早期妊娠第1～8天表達(dá)的熒光定量PCR 結(jié)果；B: Hmga2 mRNA 在妊娠第5天著床位點(5N)和非著床位點(5I)表達(dá)的熒光定量PCR 結(jié)果。數(shù)據(jù)表示表示差異有顯著性(P<0.05)。圖1 Hmga2 mRNA在小鼠早期妊娠子宮中的表達(dá)Note. A: qPCR analysis of Hmga2 mRNA expression on days 1-8 of pregnancy. B: qPCR analysis of Hmga2 mRNA expression at the implantation sites (5-I) and inter-implantation sites (5-N) on day 5 of pregnancy. Data are shown as (± s). Asterisks denote significance (P<0.05)Fig.1 Expression of Hmga2 mRNA in the early pregnant uteri of mice

將雌鼠與成年雄鼠按照1∶2 比例合籠，次日上午見栓標(biāo)記為妊娠第1天，收集妊娠第1～8天的小鼠子宮，用生理鹽水自輸卵管或子宮中沖取胚胎為確認(rèn)妊娠。取小鼠妊娠第5～6天的子宮時，注射1%芝加哥藍(lán) 0.1 mL，5 min 后取子宮，著床位點血管通透性增加變?yōu)樗{(lán)色，分別收集著床位點及非著床位點組織。每組至少取材3只。

(2)延遲著床及激活

手術(shù)切除妊娠第4天雌鼠的雙側(cè)卵巢，然后妊娠第5天和第6天上午皮下注射孕酮(每只1 mg/0.1 mL)。第7天將小鼠分為兩組：一組皮下注射 P4(每只1 mg/0.1 mL)為延遲著床組；另一組皮下同時注射17β雌二醇(E2，每只25 ng/0.1 mL)和P4(每只1 mg/0.1 mL)為著床激活組，分別于第8天收集子宮。1%芝加哥藍(lán)確定著床激活組小鼠子宮著床位點。延遲著床組小鼠，沖洗一側(cè)子宮觀察是否有胚胎存在，另一側(cè)子宮放入液氮里冷凍。每組至少3只。

(3)人工蛻膜化

健康成年未交配雌鼠與成年結(jié)扎雄鼠合籠，取假孕第4天小鼠，一側(cè)子宮內(nèi)注射50 μL芝麻油進(jìn)行人工誘導(dǎo)蛻膜化，另一側(cè)子宮作為對照。在假孕第8天上午處死，分別收集人工誘導(dǎo)蛻膜化和對照側(cè)子宮組織，每組至少3只。

(4)卵巢類固醇激素處理

卵巢類固醇激素處理選取性成熟雌鼠，麻醉后手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后恢復(fù)兩周，皮下注射類固醇激素(激素均溶于芝麻油中)，劑量為：①對照組：每只0.1 mL 芝麻油；②P4組：每只1 mg/0.1 mL；③E2組：每只100 ng/0.1 mL；④ P4+E2組：每只1 mg P4+100 ng E2/0.1 mL。每組至少 3 只，激素注射后24 h后分別犧牲小鼠，收集子宮取材。

1.3統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1Hmga2在小鼠早期妊娠子宮中的表達(dá)實驗采用熒光定量PCR檢測

Hmga2 mRNA 在小鼠子宮內(nèi)表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，Hmga2 mRNA 在妊娠第4～8 天逐漸增高，妊娠第4天與第7天比較差異有顯著性(圖1A)；與非著床位點比較，Hmga2 mRNA 在妊娠第5天著床位點表達(dá)量顯著增強(qiáng)(圖1B)。Western blot與其結(jié)果一致(圖2)。

2.2Hmga2在小鼠延遲著床及激活子宮中的表達(dá)檢測Hmga2mRNA

在延遲著床及激活小鼠子宮中的表達(dá)，表明雌激素可激活胚泡著床，使Hmga2表達(dá)量顯著高于延遲著床小鼠(圖3)。

2.3Hmga2在小鼠子宮蛻膜化過程中的表達(dá)

通過人工誘導(dǎo)蛻膜化表明Hmga2在人工誘導(dǎo)蛻膜化子宮組織中高表達(dá)，人工誘導(dǎo)組與對照組表達(dá)差異有顯著性(圖4)。妊娠第4天小鼠子宮分離的子宮基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)雌激素和孕酮聯(lián)合處理可誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化。

2.4類固醇激素對Hmga2表達(dá)的調(diào)控

在卵巢摘除小鼠子宮中當(dāng)卵巢摘除小鼠皮下注射雌激素24 h后，皮下注射孕酮可刺激Hmga2的表達(dá)顯著增加。聯(lián)合注射雌激素和孕酮，Hmga2在子宮中的表達(dá)量增加。皮下注射雌激素后Hmga2表達(dá)增加，但差異無顯著性(圖5)。

注：Hmga2在小鼠早期妊娠第1～6天子宮中的表達(dá)；I:著床點，N：非著床點。圖2 HMGA2在小鼠早期妊娠子宮中的表達(dá)Note. Expression of HMGA2 on days 1-6 of pregnancy; I: Implantation sites, N: Inter-implantation sites.Fig.2 Expression of HMGA2 in the early pregnant uteri of mice

圖3 Hmga2在小鼠延遲著床及激活子宮中的表達(dá)Fig.3 Expression of Hmga2 in delayed implantation and activation of uteri in the mice

圖4 Hmga2在人工誘導(dǎo)蛻膜化子宮中的表達(dá)Fig.4 Expression of Hmga2 under artificial decidualization

圖5 卵巢摘除小鼠類固醇激素處理24 h后，Hmga2在子宮中的表達(dá)Fig.5 Hmga2 expression in the uteri of mice after ovariectomy and treated with steroid hormones for 24 h

3 討論

在人和小鼠妊娠過程中，蛻膜組織主要為胚胎提供營養(yǎng)物質(zhì)，并且可形成屏障防止滋養(yǎng)層細(xì)胞的過度入侵[16,17]，蛻膜組織正常發(fā)育對成功妊娠起主導(dǎo)作用。相關(guān)的研究表明，一些信號通路和關(guān)鍵的調(diào)控分子參與胚胎植入后期蛻膜組織的發(fā)育[18]。全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)中HMGA2基因為PCOS 易感基因，而PCOS患者又出現(xiàn)低妊娠率和高流產(chǎn)率的問題，并且HMGA2在PCOS子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)升高，增殖分化是子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的前提條件，而HMGA2基因與生長增殖密切相關(guān)，所以研究HMGA2在子宮內(nèi)膜容受性中的作用至關(guān)重要。HMGA2在胚胎發(fā)育階段各組織中均高表達(dá)，起到了促進(jìn)正常心臟發(fā)育、神經(jīng)干細(xì)胞自我更新、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化等多種作用，而在正常成人組織中則基本不表達(dá)，僅少量見于CD34+造血干細(xì)胞，子宮肌母細(xì)胞及睪丸細(xì)胞中[19]。本研究表明Hmga2在妊娠第3～8 天逐漸增高，與非著床位點比較，Hmga2妊娠第5天著床位點表達(dá)量顯著增強(qiáng)，提示子宮中Hmga2的表達(dá)可能與小鼠早期妊娠胚胎著床過程密切相關(guān)。Hmga2在伴隨著妊娠開始表達(dá)量逐漸增加。粘附反應(yīng)開始于妊娠第5天午夜，此時伴隨著子宮內(nèi)膜血管局部增強(qiáng)的滲透力，完成粘附反應(yīng)之后，穿過腔上皮到達(dá)基質(zhì)細(xì)胞層，該基因在胚胎著床過程子宮中的定位如何，子宮組織不同位置是否存在表達(dá)差異有待進(jìn)一步研究。

胚胎著床到子宮內(nèi)膜是成功妊娠的關(guān)鍵，胚胎著床后子宮內(nèi)膜開始發(fā)生蛻膜化，異常的蛻膜化可導(dǎo)致一些妊娠并發(fā)癥及流產(chǎn)的發(fā)生[20],人工誘導(dǎo)蛻膜化組與對照組表達(dá)差異極顯著表明，假孕第8天小鼠Hmga2在人工誘導(dǎo)蛻膜化子宮組織中高表達(dá)；胚胎激活和延遲著床組表達(dá)差異顯著，表明該基因受活化胚泡的影響。在妊娠第 6～8 天子宮基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生大量的增殖，并分化為多倍體的蛻膜細(xì)胞[21]。子宮基質(zhì)細(xì)胞正常發(fā)生蛻膜化對成功的胚胎著床是必要的，因為蛻膜組織可為胚胎發(fā)育提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，同時還具有抑制母體免疫反應(yīng)發(fā)生以及調(diào)控滋養(yǎng)層入侵子宮內(nèi)膜等功能[18,22]。

子宮內(nèi)膜容受性建立機(jī)制極其復(fù)雜，不僅受母體全身和局部的激素、免疫系統(tǒng)和各種因子表達(dá)水平的調(diào)控，而且與局部胚胎、子宮間復(fù)雜的信息交流、細(xì)胞分化發(fā)育狀態(tài)有關(guān)[23]，特別是類固醇激素對蛻膜化的啟動和維持起重要的調(diào)節(jié)作用。在正常小鼠妊娠期間，雌二醇(E2)在妊娠第1天(D1)的峰值會刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增生，而在D2隨著水平的降低，上皮細(xì)胞則開始調(diào)亡，在D3剛剛開始形成的黃體則會分泌孕酮(P4)，使子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞開始增生。D4則E2峰值會與高水平的相聯(lián)合，刺激子宮基質(zhì)細(xì)胞增生并且使子宮進(jìn)入容受性，以便于胚胎著床[24]。孕酮主要通過與其受體PR 結(jié)合發(fā)揮作用[25]。在本研究中孕酮和雌激素均可誘導(dǎo)卵巢摘除小鼠子宮Hmga2的表達(dá)，說明該基因在子宮蛻膜化反應(yīng)中受雌孕激素調(diào)節(jié)并呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)胚泡粘附在子宮腔上皮后，圍繞在著床胚胎周圍的子宮基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷大量增殖，隨后分化為蛻膜細(xì)胞，子宮基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化是以高水平表達(dá)蛻膜化分化分子和典型的形態(tài)學(xué)變化為主要特征[26]。Hmga2基因在體外過表達(dá)或降調(diào)對子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因的表達(dá)有何影響，該基因在高雄激素狀態(tài)下表達(dá)有何改變，是否伴隨著體內(nèi)外相關(guān)因子的變化有待進(jìn)一步研究。

在子宮內(nèi)膜容受窗口期中，子宮內(nèi)膜上皮分泌活動最為活躍，為胚胎著床提供一個合適的宮腔內(nèi)環(huán)境，子宮內(nèi)膜上皮是與胚胎最先接觸的子宮內(nèi)膜成分，參與胚胎在子宮內(nèi)膜上的定位、粘附與侵入。本研究著重研究了Hmga2對小鼠蛻膜化過程中的作用，Hmga2的表達(dá)與小鼠早期妊娠胚胎著床過程密切相關(guān)，參與子宮內(nèi)膜蛻膜化過程，受活化胚泡的影響和類固醇激素的調(diào)控。

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ExpressionandregulationofPCOSsusceptiblegeneHmga2inmouseuterinedecidualization

CAO Yong-zhi1,2, ZHAO Yue-ran2, LIN De-gui1*

(1. College of Veterinary Medicine, China Agriculture University, Beijing 100193, China； 2. Center for Reproductive Medicine, Shandong University, Jinan 250021)

ObjectiveTo study the expression and regulation of polycystic ovary syndrome (PCOS) susceptibility geneHmga2 in endometrial receptivity and decidualization.MethodsExperiments including early pregnancy, delayed implantation and activation, artificial decidualization and ovarian steroid hormone treatment were performed, and Q-PCR and Western blot analyses were applied to explain the role ofHmga2 in endometrial receptivity.ResultsTheHmga2 expression increased gradually with pregnancy. Its expression at the implantation site was significantly higher than that at the inter-implantation site，in the embryo activation group than in delayed implantation group, and in the artificial decidualization than the non-decidualization. The expression ofHmga2 was positively correlated with the expression of estrogen and progesterone, and was positively regulated by estrogen and progesterone in vivo.ConclusionsOur findings indicate that the expression ofHmga2 is closely related to the embryo implantation process in early pregnancy in mice, is involved in the process of endometrial decidualization, and is influenced by the activated blastocyst and steroid hormones.

Polycystic ovary syndrome; PCOS;Hmga2; Decidualization; Embryos; Mouse

LIN De-gui. E-mail： csama@sina.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0473-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.002

2017-02-28

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31572578)。

曹永芝(1983-)，男，博士研究生，實驗師，專業(yè)：臨床獸醫(yī)。Email: yz_cao@163.com

林德貴(1961-)，男，教授，研究方向：小動物疾病。Email: csama@sina.com