劉燦，海寶，張穩(wěn)，?？⌒?，王紅,2，李子健，徐迎勝，宋純理,2*

(1. 北京大學第三醫(yī)院骨科，北京 100191； 2. 脊柱疾病研究北京市重點實驗室，北京 100191； 3. 北京大學第三醫(yī)院心內科，北京 100191； 4. 北京大學第三醫(yī)院神經內科，北京 100191)

研究報告

骨內單次注射小劑量辛伐他汀對大鼠心梗后血管新生的影響

劉燦1，海寶1，張穩(wěn)1，?？⌒?，王紅1,2，李子健3，徐迎勝4，宋純理1,2*

(1. 北京大學第三醫(yī)院骨科，北京 100191； 2. 脊柱疾病研究北京市重點實驗室，北京 100191； 3. 北京大學第三醫(yī)院心內科，北京 100191； 4. 北京大學第三醫(yī)院神經內科，北京 100191)

目的研究骨內局部單次注射小劑量辛伐他汀對大鼠心梗后血管新生和心功能的影響。方法Wistar 大鼠隨機分為假手術組、心肌梗死模型組和骨內注射辛伐他汀組(n=12)。冠狀動脈左前降支結扎建立大鼠心肌梗死模型。24 h后實驗組左脛骨內單次注射辛伐他汀0.5 mg，4 周后分別通過小動物超聲心動圖評價左室功能，三苯基氯化四氮唑(TTC)染色計算心肌梗死面積，免疫熒光染色檢測局部血管新生情況。結果超聲心動圖結果表明心肌梗死 4 周后左心室收縮功能明顯下降，骨內注射辛伐他汀對大鼠心肌梗死后左心室功能未見明顯改善；TTC染色發(fā)現骨內注射辛伐他汀組心肌梗死面積未見明顯減少；免疫熒光染色顯示，骨內注射辛伐他汀組心肌血管密度沒有顯著增加。結論大鼠心梗24 h后骨內單次注射小劑量辛伐他汀(0.5 mg)，心肌梗死面積、血管新生及心臟功能無顯著改善。

骨內注射；辛伐他??；血管新生；心肌梗死；內皮祖細胞

傳統(tǒng)觀念認為骨骼是儲藏鈣磷、保護內臟的惰性器官。近年來研究發(fā)現骨骼還是重要的內分泌器官，被視為整合生理學的典范，不僅是靶器官，還是重要的調控器官[3,4]，并通過“骨-血管軸”影響血管功能[5]。骨骼不僅包含成骨細胞、破骨細胞和骨細胞，還有豐富巨噬細胞、神經和脂肪組織等，更富集大量的內皮細胞、造血干細胞等。骨骼通過造血干細胞龕(niche)，即骨龕和血管龕協(xié)同調控內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的增殖、動員和分化[6,7]，EPCs可募集至缺血損傷部位，參與血管新生、促進損傷修復[8]。

研究發(fā)現，目前廣泛用于治療高膽固醇血癥的他汀類藥物還具有促進成骨、成血管等多效作用[9,10]，并促進EPCs的動員[11,12]。但他汀類藥物的靶器官是肝臟，口服后不到5%能夠進入血液循環(huán)，骨骼中的濃度更低[10]，局部施用辛伐他汀將提高其降脂外作用的生物利用度。骨內注射(intraosseous injection, IO)方法已有近百年的歷史，具有簡單、快速的特點，骨內注射的藥物能夠很快進入血液循環(huán)[13]，其局部藥物停留時間短，而泊洛沙姆407溫敏性水凝膠具有很好的藥物緩釋作用，可作為骨內注射藥物的緩釋載體[9]，同時骨髓腔為骨內給藥提供了絕佳的空間。我們在前期研究中發(fā)現，骨內單次注射小劑量辛伐他汀動員EPCs促進1型糖尿病大鼠創(chuàng)面組織的血管新生，加快糖尿病皮膚創(chuàng)面的愈合過程(實驗結果另文發(fā)表)。我們由此設想骨內單次注射小劑量辛伐他汀是否也可以促進心肌梗死后的血管新生。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠36只，6～7周齡，體重180～200 g，購于北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部【SCXK(京)2016-0010】。所有大鼠組織取材于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心動物實驗設施內進行【SYXK(京)2016-0041】。所有動物實驗設計均通過北京大學第三醫(yī)院動物倫理審查委員會的批準。

1.1.2 儀器及試劑

小動物呼吸機(上海奧爾科特公司)；Vevo2100型高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司)；顯微鏡(萊卡公司)；冰凍切片機(萊卡公司)；電子分析天平(上海精密儀器公司)；三苯基氯化四氮唑(Sigma公司)；OCT冰凍切片包埋劑(日本Tissue-Tek公司)；免疫熒光所用抗體(vWF, Santa Cruz Biotechnology; α-SMA, Abcam; Alexa Flour 488/ 594, Life Technologies-Invitrogen; Hoechst 32442, 北京索萊寶公司)。

1.1.3 藥物

按照本課題組的制備方法[9,14]，配制溫敏性辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠。將泊洛沙姆407(BASF, Ludwigshafen, Germany; 25%, w/w)緩慢加入等張的磷酸鹽緩沖液中(PBS, pH 7.4, 4℃)，均勻攪拌直至溶液完全澄清。將辛伐他汀加入已配制好的泊洛沙姆溶液中(4℃)，攪拌均勻，辛伐他汀終濃度為5 mg/mL。

1.2方法

1.2.1 大鼠心梗模型的制備

參照文獻[15]制作大鼠心肌梗死模型，腹腔內注射10%的水合氯醛(3.3 mL/kg)麻醉，氣管插管后應用動物呼吸機予以空氣人工通氣。開胸暴露出心臟，在左心耳根部與肺動脈圓錐交點下方大約2 mm處結扎冠狀動脈左前降支，結扎成功可見心尖部位心肌變蒼白。假手術組只穿線不結扎。術后關胸常規(guī)肌注30×104U青霉素。實驗分為假手術組(Sham,n=12)、心梗模型組(MI,n=12)和脛骨內注射辛伐他汀0.5 mg組(Sim 0.5 mg,n=12)。

術后24 h，脛骨內注射辛伐他汀0.5 mg組大鼠腹腔注射麻醉，仰臥位固定大鼠，于大鼠左脛骨近端常規(guī)備皮，消毒，鋪巾。在其左側膝關節(jié)用1 mL注射器于髁間窩部向髓腔內注射辛伐他汀0.5 mg。

1.2.2 超聲心動檢測

使用Vevo 2100型高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)，在二維圖像的引導下取M型曲線并進行測量，測量的指標包括：左心室收縮末期前臂厚度(AWST)和舒張期前壁厚度(AWDT)；左室收縮末期內徑(LVESD)和舒張末期內徑(LVEDD)；左心室短軸縮短率(FS)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD × 100%；左心室射血分數(EF)=SV/LVEDV × 100%。

1.2.3 大鼠心肌肥厚程度檢測

將取出的心臟用預冷的PBS沖洗去血液，濾紙吸干游離的水分，稱重。取大鼠脛骨，測量其長度。以心臟重量與脛骨長度的比值(HW/TI, mg/mm)來衡量心臟肥大程度[16]。

1.2.4 三苯基氯化四氮唑(TTC)染色

參照文獻介紹的方法[17]，大鼠心梗24 h后骨內注射辛伐他汀4周后，取心臟標本冷凍并沿心臟縱軸連續(xù)切片，將心室部分每隔2 mm橫斷切成4片，置入1% TTC溶液中，37℃避光孵育15 min，在體視顯微鏡下觀察，Image J軟件統(tǒng)計分析心肌梗死區(qū)面積。

1.2.5 免疫熒光

取材的創(chuàng)面組織4%多聚甲醛室溫固定24 h后，PBS清洗。30%蔗糖溶液脫水24 h后，標本通過OCT包埋并液氮凍存。冰丙酮固定切好的冰凍切片(6 μm)10 min，0.3% Triton X孵育10 min，接著血清封閉液室溫封閉30 min。一抗為小鼠抗vWF、兔抗α-SMA，二抗為Alexa Flour 488，Alexa Flour 594；Hoechst 32442復染細胞核。熒光顯微鏡下隨機選取10個視野，Image J軟件統(tǒng)計分析毛細血管及小動脈血管密度。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1骨內注射辛伐他汀未見其改善心梗后大鼠的心臟功能

心臟二維超聲檢測結果表明，在心梗術后第4周，左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期前壁厚度(AWST)、左室舒張末期前壁厚度(AWDT)、左室短軸縮短率(FS)、左室射血分數(EF)等指標與假手術組相比明顯下降，標志著心梗模型的成功建立(表1)。骨內注射辛伐他汀組與心肌梗死模型組相比，左室收縮期內徑、左室舒張期內徑、左室收縮期前壁厚度、左室舒張期前壁厚度、左室短軸縮短率及左室射血分數等指標差異無顯著性(表1)。

表1 心臟二維超聲檢測結果Tab.1 Results of echocardiographic evaluation of the hearts

注：與假手術組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the sham group,*P<0.05.

2.2心肌梗死后大鼠體重及心臟大體變化情況

實驗期間每周監(jiān)測大鼠的體重，大鼠心梗模型組體重與假手術組明顯降低，且這種差異在整個實驗觀察期間都存在，骨內注射辛伐他汀組大鼠體重與心梗模型組相比差異無顯著性(P>0.05，圖1A)，各組間心脛比結果差異無顯著性(P>0.05，圖1B)。處死取材后可見心肌梗死模型組左心室前下壁因缺血缺氧而明顯變薄(圖2)。

2.3骨內注射辛伐他汀對心肌梗死后面積的影響

心肌進行TTC染色，白色為心肌梗死區(qū)域，紅色為正常心肌區(qū)域，我們發(fā)現在心肌梗死模型組和Sim 0.5 mg組，其梗死面積均在30%～40%之間，差異無顯著性(圖3，P>0.05)。

2.4骨內注射辛伐他汀對梗死后心肌的微血管密度的影響

選用vWF與α-SMA進行免疫熒光雙標評價血管密度，其中vWF代表毛細血管、α-SMA代表小動脈血管密度(圖4)。心肌梗死后其血管密度顯著高于假手術組(P<0.05)，但在心梗模型組與骨內注射辛伐他汀組之間血管密度差異無顯著性(P>0.05)。

圖1 大鼠體重動態(tài)變化(A)及心脛比統(tǒng)計圖(B)。*P<0.05Fig.1 Dynamic changes of body weight and analysis of the heart weight/tibia length ratios

圖2 骨內單次注射辛伐他汀(0.5 mg)4周后各組心臟大體觀Fig.2 Gross appearance of the heart at 4 weeks after single intraosseous injection of simvastatin (0.5 mg)

圖3 大鼠心肌梗死24 h后IO辛伐他汀4周，TTC染色及梗死面積統(tǒng)計Fig.3 TTC staining and statistical analysis of the myocardial infarction at 4 weeks after intraosseous injection of simvastatin

3 討論

傳統(tǒng)觀念認為骨骼是支持機體基本結構和參與運動及鈣磷代謝的“惰性器官”，近年來研究發(fā)現骨骼也是重要的“內分泌器官”[18]，骨骼中的成骨細胞、破骨細胞及骨細胞等能主動合成和分泌多種骨調節(jié)蛋白、細胞因子、和心血管活性肽等多種生物活性物質，通過外周血液循環(huán)以遠距離分泌的方式來調節(jié)遠隔器官組織的代謝和功能，被視為整合生理學的典范[3,4]。而“骨-血管軸”概念的提出更是表明骨骼與血管之間有著密切的聯(lián)系，能相互調節(jié)[19]。骨骼不僅包含成骨細胞、破骨細胞和骨細胞，還有豐富的內皮細胞、巨噬細胞、神經和脂肪，更富集大量造血干細胞、骨髓基質干細胞。

本實驗證實，通過結扎左冠狀動脈前降支造成的大鼠心肌梗死模型，大鼠心梗后4周其左心室收縮泵血功能明顯下降，同時左心室明顯擴大，缺血區(qū)的心室壁變薄塌陷。大量研究證明，心肌梗死后通過刺激局部區(qū)域的血管新生和微血管側支循環(huán)，使得心肌生長和血管系統(tǒng)之間保持一個相對均衡的狀態(tài)，對于梗死或者缺血心肌的修復和心肌功能的提高至關重要[20]。心肌缺血可產生相應的刺激因子來啟動血管新生，但不足以充分代償冠脈阻塞造成的血供不足[2]。我們的結果也發(fā)現大鼠心肌梗死后其血管密度明顯高于假手術組，表明心肌缺血缺氧后可通過上調促血管生成因子或者動員內源性的成血管細胞來促進血管新生。

目前臨床上治療心肌梗死的方法主要有4種：藥物治療、經皮冠脈介入術、冠脈旁路搭橋術和骨髓間充質干細胞移植術[21]。雖然這些治療方法在臨床上被普遍應用并取得了很大進展，但由于受多種因素的限制以及其治療后的高復發(fā)率而不能滿足臨床治療的需求。

治療性血管新生是目前世界醫(yī)學領域研究的熱點，將外源性成血管因子或成血管細胞以不同的方式植入體內缺血部位，通過在原有的血管系統(tǒng)基礎上促進或者誘導側支血管的新生來恢復受損缺血心肌的血流恢復，從而改善患者的癥狀和預后[1,2]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一類能歸巢于缺血部位并可以直接分化為血管內皮細胞的前體細胞，能參與血管新生及機體局部缺血組織的修復，這為改善心肌的灌注，從而提高心肌梗死后的心功能成為可能[22]。骨髓是EPCs的主要來源，而在正常生理狀態(tài)下，骨髓中的EPCs位于骨髓龕中，處于靜息狀態(tài)，外周循環(huán)中EPCs的數量是非常有限的。正常人體，即使老年人也大量存在內源性的EPCs，如何通過動員內源性EPCs，使得外周血中EPCs數量大大增加，或為缺血性損傷的治療帶來新的希望。

有研究發(fā)現，他汀類藥物能有效促進EPCs的增殖、分化、遷移和粘附能力[23]，增強EPCs的動員，從而促進血管新生[11]。此外，他汀類藥物一方面可直接通過不同作用機制延緩心梗后心室重構進程，從而對心功能起著一定的保護作用[12,24-29]，另一方面還能促進心梗后的血管新生[30]。本課題前期研究發(fā)現，骨骼局部應用辛伐他汀能有效動員EPCs至外周循環(huán)血，并能通過促進EPCs動員及組織血管新生，而加快1型糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合速率(實驗數據另文發(fā)表)。因此基于以上理論基礎，我們推測骨內局部注射辛伐他汀可通過動員EPCs促進大鼠心梗后血管新生，從而對心功能發(fā)揮保護作用。但本實驗結果發(fā)現，心梗后4周通過小動物二維超聲檢測大鼠左心功能，發(fā)現其左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期前壁厚度(AWST)、左室舒張末期前壁厚度(AWDT)、左室短軸縮短率(FS)、左室射血分數(EF)等左心功能指標顯著下降，而未見骨內注射辛伐他汀顯著改善心梗后心功能的作用。

雖然有報道他汀類藥物可以通過其抗炎、減輕氧化應激等機制來改善心梗后心功能[26,27,29,31,32]，但治療時間長。在本實驗中，我們給藥的時間選擇在造成心梗模型后24 h，可能因其錯過了治療時間窗而沒能發(fā)揮促進血管新生的作用；或者骨內單次注射辛伐他汀可能因藥物作用時間過短，而沒能表現出心臟保護作用。正常情況下，缺血性損傷會動員內源性EPCs歸巢至缺血損傷部位，參與血管新生、促進損傷修復。但在糖尿病、高血脂、衰老等病理狀態(tài)下，EPCs的動員受到影響，使得缺血損傷誘導的血管新生障礙，從而影響組織再生修復[33,34]。我們之前的研究是在1型糖尿病大鼠模型中發(fā)現骨內單次注射辛伐他汀促進EPCs動員、血管新生和損傷修復，而在本研究中采用正常大鼠，其EPCs動員正常，而辛伐他汀骨內注射后并未顯著促進EPCs動員，從而使得心梗后血管新生沒有顯著差異。

另外，心臟的循環(huán)血液供應不同于其他器官，心肌收縮過程中對供應心肌血供的血管產生快速擠壓，循環(huán)中的EPCs難以在缺血損傷的心肌局部滯留繼而發(fā)揮成血管作用，如同腫瘤細胞很難轉移到心臟一樣[35]，即使大量的EPCs動員到循環(huán)中，仍難以在缺血損傷部位滯留從而發(fā)揮促進血管新生和損傷組織的修復再生作用。

總之，骨內注射小劑量辛伐他汀雖然可以動員內源性EPCs，促進糖尿病大鼠血管新生和缺血性損傷組織的修復，但對大鼠心肌梗死并未觀察到明顯的促血管新生作用，其中的原因和未來解決對策有待于進一步深入研究。

志謝：感謝首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心許晴老師對大鼠心梗超聲心動檢測的幫助。

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Effectofsingleintraosseousinjectionofsimvastatinonneoangiogenesisinmyocardialinfarctioninrats

LIU Can1, HAI Bao1, ZHANG Wen1, ZHU Jun-xiong1, WANG Hong1,2, LI Zi-jian3, XU Ying-sheng4, SONG Chun-li1,2*

(1. Department of Orthopedics, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China； 2. Beijing Key Laboratory of Spinal Diseases, Beijing 100191； 3. Department of Cardiology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191； 4. Department of Neurology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191)

ObjectiveTo explore the effect of single local intraosseous injection of small dose simvastatin on the angiogenesis and cardiac function in rats after myocardial infarction.MethodsAdult male Wistar rats were divided into sham operation group, myocardial infarction model group and intraosseous injection of simvastatin 0.5 mg group (alln=12 per group). The left anterior descending branch of coronary artery was ligated to establish a rat model of myocardial infarction. The left ventricular function was evaluated by small animal echocardiography at 4 weeks postoperatively. The rest of the rats were sacrificed, the myocardial infarct size was evaluated by TTC staining, and the myocardial neovascularization was detected by immunofluorescence staining.ResultsWe successfully established the rat model of myocardial infarction. The echocardiography showed that the left ventricular systolic function was decreased significantly at 4 weeks after myocardial infarction. Intraosseous injection of simvastatin (0.5 mg) did not improve the left ventricular function after myocardial infarction in the rats. TTC staining showed that intraosseous injection of simvastatin did not reduce myocardial infarct size. Immunofluorescence staining showed that the myocardial capillary density of simvastatin group was slightly higher than that of myocardial infarction model group, but showing no significant difference between them.ConclusionsIntraosseous injection of simvastatin 0.5 mg 24 hours after myocardial infarction cannot significantly promote myocardial angiogenesis, which is believed to be beneficial to the revascularization after ischemia, and thus failed to improve the cardiac function.

Intraosseous injection; Simvastatin; Neovascularization; Myocardial infarction; Endothelial progenitor cells

SONG Chun-li. Email： schl@bjmu.edu.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0506-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.007

治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)，又稱“藥物搭橋”，即通過藥物等某些干預措施，促進缺血組織的血管新生，為缺血損傷提供了新的治療策略[1]。有臨床前實驗表明，通過使用促血管生成因子重組蛋白、基因及干/祖細胞移植等方法能有效增強新的側支血管形成來改善缺血癥狀[2]。但存在干細胞來源、倫理等限制。如何動員內源性干細胞，促進缺血損傷組織的血管新生將為治療性血管新生提供新的研究方向。

2017-01-05

國家自然科學基金(NO.81672133，81641079)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃NO.2015AA020304)。

劉燦(1991-)，男，碩士研究生，專業(yè)：外科學。Email： lcdyx2014@126.com

宋純理(1971-)，男，博士生導師，研究員，研究方向：骨質疏松、骨折愈合。Email： schl@bjmu.edu.cn