劉俊彥，李繼文，王 川

(中國石化上海石油化工研究院，上海 201208)

高效液相色譜-電噴霧式檢測器測定生物質(zhì)制乙酰丙酸反應(yīng)中纖維素水解產(chǎn)物的單糖組成

劉俊彥，李繼文，王 川

(中國石化上海石油化工研究院，上海 201208)

建立了高效液相色譜-電噴霧式檢測器測定生物質(zhì)制乙酰丙酸反應(yīng)中纖維素水解產(chǎn)物的單糖組成的方法。采用XBridge Amide C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，以85%乙腈水溶液(含0.025%氨水)為流動(dòng)相，色譜柱溫70 ℃，流速1 mL·min-1，分析周期10 min。標(biāo)樣測定結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線性響應(yīng)，回歸系數(shù)(R2)均大于0.99，最低檢出限為0.001 g·L-1。實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率在89.74%～107.58%之間，6次重復(fù)測定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%。該方法分析速度快，靈敏度高，分離效果好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，數(shù)據(jù)精密度良好，無需進(jìn)行糖類衍生化反應(yīng)，為纖維素水解產(chǎn)物的單糖組成分析提供了一種新的簡便、快速、準(zhǔn)確的方法。

高效液相色譜；電噴霧式檢測器；纖維素；單糖；生物質(zhì)；乙酰丙酸

隨著自然資源的不斷消耗，積極探尋和開發(fā)新能源體系迫在眉睫，由可再生的生物質(zhì)原料生產(chǎn)平臺(tái)化合物的探索已成為研究熱點(diǎn)[1-2]。平臺(tái)化合物具有非常好的反應(yīng)特性，可以衍生出眾多高附加值的下游產(chǎn)品，為化工行業(yè)開辟出新的應(yīng)用領(lǐng)域[3]。乙酰丙酸作為一種重要的平臺(tái)化合物備受關(guān)注[4-5]。乙酰丙酸通過各類化學(xué)反應(yīng)可制得塑料改性劑、溶劑、香料、農(nóng)藥中間體、聚合物添加劑、潤滑油添加劑、化妝品添加劑等[6-9]。目前，乙酰丙酸可由生物質(zhì)纖維素水解成六碳糖單體和低聚物，在高溫酸性條件下繼續(xù)降解成5-羥甲基糠醛后轉(zhuǎn)化得到[10-14]。纖維素水解為單糖是重要的反應(yīng)步驟，快速準(zhǔn)確獲得產(chǎn)物中單糖的定量信息，對(duì)優(yōu)化生物質(zhì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件有著決定性作用。

糖類化合物可以通過液相色譜進(jìn)行分離，但因其不含發(fā)色基團(tuán)，因此通過常規(guī)手段(如紫外檢測)對(duì)其進(jìn)行直接檢測比較困難。針對(duì)糖類的非痕量分析，可以使用示差折光[15]、蒸發(fā)光散射[16-18]等技術(shù)進(jìn)行檢測；針對(duì)糖類的痕量分析，可以采用柱前衍生-高效液相色譜方法配合紫外或熒光檢測器進(jìn)行檢測。使用紫外檢測器，可以采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進(jìn)行柱前衍生；使用C18反相色譜柱，紫外檢測波長為250 nm[19-20]；使用熒光檢測器，可以采用氨基吡啶類、酰肼類、苯胺類、氨基苯甲酸酯類熒光試劑進(jìn)行柱前衍生，實(shí)現(xiàn)痕量糖類的高靈敏度分析[21]。柱前衍生方法的檢測靈敏度較高，但衍生反應(yīng)相對(duì)耗時(shí)。針對(duì)不同的樣品體系，需要使用適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法方可進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

電噴霧式檢測器(CAD)是一種通用型液相色譜檢測器，具有不依賴化學(xué)結(jié)構(gòu)的信號(hào)響應(yīng)一致性[22]，適用于分析各種不揮發(fā)或揮發(fā)性較差的化合物，尤其對(duì)不能使用紫外檢測器檢測的化合物(如糖類等)具有較大的優(yōu)勢[23-25]。

基于現(xiàn)有的HPLC分析糖類化合物的方法，作者選擇合適的色譜柱與流動(dòng)相，將HPLC-CAD技術(shù)應(yīng)用于生物質(zhì)制乙酰丙酸流程中的纖維素水解產(chǎn)物單糖組成的分析，使用CAD對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析，擬為新型工藝開發(fā)提供一種新的簡便、快捷、準(zhǔn)確的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

木糖、果糖、葡萄糖、甲酸、甲酸銨純度均大于99%，氨水(純度28%)，Sigma公司；乙腈(HPLC級(jí))，Thermofisher公司；Milli-Q超純水。

Thermo Ultimate 3000型HPLC-CAD，Amide色譜柱(Waters，XBridge，4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，Amino色譜柱(Thermo Scientific，Hypersil GOLD，4.6 mm×150 mm，5 μm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品化合物溶于超純水中，配制成10 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液。分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，用50%乙腈水溶液稀釋，即得1#～5#系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(化合物濃度為0.05～2.00 g·L-1)。

1.3 HPLC-CAD分析條件

HPLC采用等度洗脫模式，流動(dòng)相為85%乙腈水溶液(含0.025%氨水)，流速為1 mL·min-1， 色譜柱溫為70 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。CAD霧化氣為N2，霧化氣壓力為0.2 MPa，霧化溫度為30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器的選擇

CAD 與蒸發(fā)光散射檢測器(evaporative light scattering detector，ELSD) 都是基于霧化-氣溶膠的高效液相色譜檢測器，通過霧化蒸發(fā)液相色譜流動(dòng)相后對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測。2種檢測器均可作為紫外檢測器的補(bǔ)充，對(duì)于檢測無紫外吸收或吸收較弱的化合物具有一定優(yōu)勢。CAD與ELSD的區(qū)別在于：CAD是基于帶電粒子的電信號(hào),ELSD則基于目標(biāo)化合物散射光信號(hào)。與ELSD相比，CAD在低濃度范圍具有更好的線性響應(yīng)，因此更適用于液相色譜梯度洗脫分離條件。

2.2 色譜柱的選擇

通常使用氨基柱(Amino色譜柱)對(duì)單糖進(jìn)行分離，采用等度洗脫模式，流動(dòng)相為85%乙腈水溶液。在該色譜條件下，使用CAD對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。

圖1 等度洗脫模式下，Amino色譜柱分離3種單糖的典型圖譜Fig.1 Typical spectrum of three monosaccharideswith Amino column at isocratic elution

從圖1可以看出，3種單糖未能完全基線分離。因此，嘗試使用以酰胺鍵為固定相基團(tuán)的Amide色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。

2.3 流動(dòng)相的選擇

使用Amide色譜柱對(duì)單糖進(jìn)行分離，采用等度洗脫模式，以85%乙腈水溶液為流動(dòng)相時(shí)的典型圖譜如圖2a、b、c所示，在85%乙腈水溶液流動(dòng)相中分別添加5 mmol·L-1甲酸銨、0.1%甲酸、0.0025%氨水的典型圖譜如圖2d、e、f所示，在85%乙腈水溶液流動(dòng)相中添加不同濃度氨水的典型圖譜如圖2g、h、i所示。

流動(dòng)相：a～c為85%乙腈水溶液，d為85%乙腈水溶液+5 mmol·L-1甲酸銨，e為85%乙腈水溶液+0.1%甲酸，

由圖2a、b、c可以看出，以85%乙腈水溶液為流動(dòng)相時(shí)，3種單糖均出現(xiàn)了色譜峰分叉現(xiàn)象，且提高色譜柱溫不能明顯改善峰型。由圖2d、e、f可以看出，在85%乙腈水溶液流動(dòng)相中加入甲酸銨或甲酸后，3種單糖的分離效果更差；加入0.0025%氨水則可以明顯改善色譜峰型(柱溫為70 ℃)。由圖2f、g、h可以看出，70 ℃下，提高85%乙腈水溶液流動(dòng)相中的氨水濃度有利于改善色譜峰型，以0.025%氨水效果最佳，氨水濃度過高對(duì)色譜分離效果沒有明顯改善(圖2h)。

目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道過單糖標(biāo)準(zhǔn)品在Amide色譜柱上峰分叉現(xiàn)象，可能是由于單糖分子存在旋光異構(gòu)現(xiàn)象導(dǎo)致。常規(guī)Amino色譜柱對(duì)旋光異構(gòu)體沒有區(qū)分，因此不存在峰分叉的現(xiàn)象。Amide色譜柱可能由于固定相官能團(tuán)與單糖具有特殊的相互作用，因此產(chǎn)生峰分叉現(xiàn)象。氨水可能對(duì)單糖具有消旋作用，驅(qū)使單糖以單一空間結(jié)構(gòu)的形態(tài)存在，從而改善色譜峰型。

2.4 色譜柱溫與流速的選擇

分別考察70 ℃與40 ℃條件下，用含有0.025%氨水的85%乙腈水溶液作為流動(dòng)相的分離效果(圖2g、i)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較高的色譜柱溫可以改善色譜峰型與分離度。

進(jìn)一步比較0.7 mL·min-1與1 mL·min-1流速下的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低流速條件下沒有明顯改善各單糖的分離效果，并導(dǎo)致色譜峰變寬，降低了檢測靈敏度。因此，選擇流速為1 mL·min-1。

2.5 線性關(guān)系與最低檢出限

對(duì)1#～5#系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以各化合物CAD信號(hào)面積對(duì)含量進(jìn)行線性回歸，分別得到目標(biāo)化合物的線性方程、線性范圍、回歸系數(shù)(R2)與最低檢出限(LOD，S/N=3)，每份標(biāo)準(zhǔn)溶液測定6次，取平均值，結(jié)果見表1。

表1目標(biāo)化合物的線性關(guān)系與最低檢出限

Tab.1Linear relationship and limit of detection

從表1可以看出，各化合物在各自的含量范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 準(zhǔn)確性與精密度

為了考察HPLC-CAD方法的準(zhǔn)確性和精密度，在實(shí)際樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收率與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。將實(shí)際樣品加標(biāo)配制2個(gè)不同濃度的標(biāo)樣Ⅰ和Ⅱ，分別進(jìn)行定量分析，每個(gè)標(biāo)樣重復(fù)測定6次，結(jié)果見表2。

表2HPLC-CAD方法的回收率與重復(fù)性

Tab.2RecoveryrateandrepeatabilityofHPLC-CADmethod

化合物加入量g·L-1實(shí)測值g·L-1RSD%回收率%標(biāo)樣Ⅰ木糖1.211.141.8593.94果糖1.301.321.14101.81葡萄糖1.551.671.76107.58標(biāo)樣Ⅱ木糖0.740.662.3689.74果糖0.620.581.9993.58葡萄糖0.810.742.0791.66

從表 2可知，各加標(biāo)組分的回收率在89.74%～107.58%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)均小于3%，說明該方法定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，數(shù)據(jù)精密度良好。

2.7 實(shí)際樣品測定

采用 1.3色譜條件和2.5測得的線性方程，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，定量分析結(jié)果的重復(fù)性良好。

表3實(shí)際樣品測定結(jié)果(n=6)

Tab.3Determinationresultsofpracticalsamples(n=6)

化合物濃度/(g·L-1)RSD/%木糖0.861.41果糖0.712.07葡萄糖1.161.97

3 結(jié)論

采用HPLC-CAD技術(shù)實(shí)現(xiàn)了生物質(zhì)制乙酰丙酸反應(yīng)中纖維素水解產(chǎn)物單糖組分的定性和定量分析。采用XBridge Amide C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，以85%乙腈水溶液(含0.025%氨水)為流動(dòng)相，色譜柱溫70 ℃，流速1 mL·min-1，分析周期10 min。標(biāo)樣測定結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線性響應(yīng)，回歸系數(shù)(R2)均大于0.99，最低檢出限為0.001 g·L-1。實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率在89.74%～107.58%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%。該方法分析速度快，靈敏度高，分離效果好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，數(shù)據(jù)精密度良好，無需進(jìn)行糖類衍生化反應(yīng)，為纖維素水解產(chǎn)物的單糖組成分析提供了一種新的簡便、快速、準(zhǔn)確的方法。

[1] RAGAUSKAS A J,WILLIAMS C K,DAVISON B H,et al.The path forward for biofuels and biomaterials[J].Science,2006,311(5760):484-489.

[2] TUCK C O,PEREZ E,HORVATH I T,et al.Valorization of biomass:deriving more value from waste[J].Science,2012,337(6095):695-699.

[3] CORMA A,IBORRA S,VELTY A.Chemical routes for the transformation of biomass into chemicals[J].Chemical Reviews,2007,107(6):2411-2502.

[4] LEONARD R H.Levulinic acid as a basic chemical raw material[J].Industrial and Engineering Chemistry,1956,48(8):1331-1341.

[5] WERPY T A，PETERSEN G.Top value added chemicals from biomass[R]//Richland Washington,2004.

[6] BOND J Q,ALONSO D M,WANG D,et al.Integrated catalytic conversion of gamma-valerolactone to liquid alkenes for transportation fuels[J].Science,2010,327(5969):1110-1114.

[7] BOZELL J J,MOENS L,ELLIOTT D C,et al.Production of levulinic acid and use as a platform chemical for derived products[J].Resources Conservation and Recycling,2000,28(3/4):227-239.

[8] GALLEZOT P.Conversion of biomass to selected chemical products[J].Chemical Society Reviews,2012,41(4):1538-1558.

[9] SERRANO-RUIZ J C,LUQUE R,SEPULVEDA-ESCRIBANO A.Transformations of biomass-derived platform molecules:from high added-value chemicals to fuelsviaaqueous-phase processing[J].Chemical Society Reviews,2011,40(11):5266-5281.

[10] GIRISUTA B,JANSSEN L P B M,HEERES H J.Green chemicals:a kinetic study on the conversion of glucose to levulinic acid[J].Chemical Engineering Research & Design,2006,84(5):339-349.

[11] GIRISUTA B,JANSSEN L P B M,HEERES H J.Kinetic study on the acid-catalyzed hydrolysis of cellulose to levulinic acid[J].Industrial & Engineering Chemistry Research,2007,46(6):1696-1708.

[12] HUBER G W,IBORRA S,CORMA A.Synthesis of transportation fuels from biomass:chemistry,catalysts,and engineering[J].Chemical Reviews,2006,106(9):4044-4098.

[13] van de VYVER S,THOMAS J,GEBOERS J,et al.Catalytic production of levulinic acid from cellulose and other biomass-derived carbohydrates with sulfonated hyperbranched poly(arylene oxindole)s[J].Energy & Environmental Science,2011,4(9):3601-3610.

[14] WEINGARTEN R,CONNER W C,HUBER G W.Production of levulinic acid from cellulose by hydrothermal decomposition combined with aqueous phase dehydration with a solid acid catalyst[J].Energy & Environmental Science,2012,5(6):7559-7574.

[15] 劉玉峰,李黎,李東,等.高效液相色譜法測定食品中的單糖、雙糖[J].食品科學(xué),2007,28(3):293-296.

[16] 丁洪流,李燦,金萍,等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定食品中的單糖、雙糖、低聚果糖和糖醇[J].色譜,2013，31(8):804-808.

[17] 羅立梅,陳朝銀,李時(shí)琪,等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定皂莢殼多糖的單糖組分及其含量[J].理化檢測：化學(xué)分冊(cè),2013,49(3):270-273.

[18] 曾慶華,孫小凡,陳利梅.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定發(fā)芽小麥中單糖和雙糖[J].糧食與油脂,2010(10):38-40.

[19] 孟海波,高紹豐,張海燕,等.柱前衍生化-高效液相色譜法分析木糖結(jié)晶母液的單糖組成[J].化學(xué)分析計(jì)量,2011,20(5):47-49.

[20] 黎國慶,覃江克,陸海南,等.柱前衍生高效液相色譜法分析油茶多糖的單糖組成[J].食品科技,2013,38(10):282-285.

[21] 徐瑾,張慶合,張維冰,等.液相色譜熒光衍生法在糖類物質(zhì)分析中的應(yīng)用[J].色譜,2003,21(2):115-120.

[22] 劉路,高旋,楊永健.HPLC-電霧式檢測器的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2012,43(3):227-231.

[23] DIXON R W,BALTZELL G.Determination of levoglucosan in atmospheric aerosols using high performance liquid chromatography with aerosol charge detection[J].Journal of Chromatography A,2006,1109(2):214-221.

[24] INAGAKI S,MIN J Z,TOYO'OKA T.Direct detection method of oligosaccharides by high-performance liquid chromatography with charged aerosol detection[J].Biomedical Chromatography，2007,21(4):338-342.

[25] CLOS J F,DUBOIS G E,PRAKASH I.Photostability of rebaudioside A and stevioside in beverages[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2008,56(18):8507-8513.

DeterminationofMonosaccharideCompositioninCelluloseHydrolysateDuringtheProductionofLevulinicAcidfromBiomassbyHighPerformanceLiquidChromatographywithChargedAerosolDetection

LIU Jun-yan,LI Ji-wen,WANG Chuan

(SINOPECShanghaiResearchInstituteofPetrochemicalTechnology,Shanghai201208,China)

We established the determination method of monosaccharide composition in cellulose hydrolysate during the production of levulinic acid from biomass by high performance liquid chromatography(HPLC) with charged aerosol detection(CAD).Using 85% acetonitrile water solution containing 0.025% ammonia as an mobile phase,an XBridge Amide C18column(4.6 mm×150 mm,3.5 μm) was applied for the separation coupled with CAD within 10 min,the column temperature was 70 ℃,and the flow rate was 1 mL·min-1.Determination results of standard samples showed a good linear relationship with the corresponding concentration,and the linear regression coefficients were greater than 0.99.The limit of detection of the method was 0.001 g·L-1.The adding standard recoveries of real samples were 89.74%～107.58%,and relative standard deviation(RSD) was less than 3% for six repeatable detection.The method provides a new strategy for simple,rapid,and accurate analysis of monosaccharide composition in cellulose hydrolysate during the production of levulinic acid from biomass with fast analysis,high sensitivity,good separation efficiency,accuracy and reliability,good precision,and no glycosyl derivatization.

high performance liquid chromatography;charged aerosol detection;cellulose;monosaccharide;biomass;levulinic acid

O657.72

A

1672-5425(2017)10-0065-05

2017-04-26

劉俊彥(1984-)，男，上海人，博士，高級(jí)工程師，研究方向：色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，E-mail:liujy.sshy@sinopec.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.015

劉俊彥，李繼文，王川.高效液相色譜-電噴霧式檢測器測定生物質(zhì)制乙酰丙酸反應(yīng)中纖維素水解產(chǎn)物的單糖組成[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(10)：65-69.