閆 斌， 朱明振， 李衛(wèi)君， 賈麗景

自身免疫調(diào)節(jié)因子在重癥肌無力患者胸腺內(nèi)的表達(dá)及作用分析

閆 斌1， 朱明振1， 李衛(wèi)君1， 賈麗景2

目的比較自身免疫調(diào)節(jié)因子(AIRE)在重癥肌無力(MG)患者及正常人胸腺內(nèi)的含量，分析AIRE在MG發(fā)病中的作用。方法收集濮陽市人民醫(yī)院胸外科MG胸腺切除患者的胸腺組織及心臟外科手術(shù)患者的胸腺組織，將其分為MG合并胸腺異常組(A)、MG胸腺正常組(B)、對照組(C)。采用蛋白免疫印跡法及熒光定量PCR法比較3組胸腺內(nèi)AIRE基因及蛋白含量。結(jié)果C組(0.75±0.04)AIRE基因含量明顯高于A(0.42±0.08)、B(0.45±0.08)兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A、B兩組之間AIRE基因含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C組(0.72±0.05)AIRE蛋白含量較A(0.40±0.08)、B(0.50±0.05)兩組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A、B兩組之間蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論MG患者胸腺內(nèi)AIRE基因及蛋白含量較對照組偏低，而與胸腺病理類型無關(guān)，AIRE在MG發(fā)病過程中有重要作用。

自身免疫調(diào)節(jié)因子； 重癥肌無力

重癥肌無力(MG)是由多種抗體介導(dǎo)的發(fā)生在神經(jīng)肌肉接頭處的自身免疫性疾病[1]，有研究表明，MG的發(fā)生與胸腺關(guān)系密切，約75%的MG患者胸腺發(fā)生異常，其中約85%為胸腺增生，約15%為胸腺瘤[2]，自身免疫調(diào)節(jié)因子(AIRE)與大多數(shù)胸腺異常有關(guān)，研究認(rèn)為AIRE蛋白參與了胸腺T細(xì)胞的發(fā)育及分化過程[3]，已經(jīng)證實(shí)MG的發(fā)病主要與T淋巴細(xì)胞的異?；罨嘘P(guān)，而AIRE在胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞刪除自身抗原過程中有重要作用，參與自身抗原耐受的調(diào)節(jié)，AIRE與胸腺細(xì)胞的發(fā)育關(guān)系密切[4]，但AIRE因子在MG患者胸腺內(nèi)的表達(dá)情況及其在MG發(fā)病過程中的作用仍少有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKa Ra公司)，鼠抗人AIRE抗體(美國Sana cruz公司)，兔抗人β-actin抗體(北京博奧森公司)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(武漢博士德公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(北京中杉金橋公司)，AIRE引物序列由上海生工有限公司合成。

1.1.1 一般資料 選取2013年1月-2017年1月在濮陽市人民醫(yī)院胸外科住院行胸腺切除術(shù)治療的MG患者37例，均符合重癥肌無力診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。其它原因的肢體無力疾病及就診前3 m應(yīng)用過免疫抑制劑者除外，其中男性15例，女性22例，年齡3～45歲，平均年齡(23.5±2.5)歲，胸腺異常者20例，胸腺正常17例。眼肌型27例，全身型10例；選擇同期在心臟外科行開胸手術(shù)的15例心臟手術(shù)患者的部分胸腺標(biāo)本為對照組，男9例，女6例，年齡4～40歲，平均年齡(18.5±3.5)歲，排除重癥肌無力及其他自身免疫疾病、且在3 m內(nèi)未使用過免疫抑制類及激素類藥物，對照組胸腺病理切片為正常胸腺組織。兩組在年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有患者均簽署知情同意書，并由濮陽市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有胸腺標(biāo)本取出后立即存放于液氮中。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 A組為MG患者的異常胸腺標(biāo)本;B組為MG患者的正常胸腺標(biāo)本;C組為對照組即正常人的正常胸腺標(biāo)本。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測3組AIRE mRNA含量 在Gene Bank中獲得人AIRE序列，Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，上游引物序列5’-CAACGGGTCCTGCCCAACAG-3’，下游引物序列5’-CGCATACATGGCCTATAACAT-3’；β-actin作為內(nèi)參，其上游引物序列為5’-GGCCCGGACACGTCATTCT-3’，下游引物序列為5’-CCGGGCACGCAGCACCAT-’，分別取上述3組胸腺組織30 mg，用Trizol一步法分別提取3組RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，熒光定量PCR法采用20 μl反應(yīng)體系,熒光變性反應(yīng)條件為95 ℃30 s；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s、55 ℃ 2 min、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；取10 μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以確保引物設(shè)計(jì)的特異性。將內(nèi)參基因Ct值與目的基因的Ct值之比作為標(biāo)準(zhǔn)化的目的基因相對定量，即β-actin的拷貝數(shù)/目的基因拷貝數(shù)。

1.2.3 蛋白免疫印跡法檢測3組AIRE蛋白含量 分別取上述3組胸腺組織標(biāo)本各30 mg，液氮中快速研磨得到勻漿，加入裂解液，室溫避光40 min，6000 rpm離心5 min后取上清，BCA法測3組蛋白濃度，每孔加20 μl樣品，β-actin作為內(nèi)參，稀釋比例1∶1500鼠抗人AIRE抗體及1∶2000兔抗人β-actin抗體冰箱內(nèi)4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫40 min，稀釋比例1∶5000 HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體和1∶5000 HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，在37 ℃水浴箱孵育1 h，曝光成膠片，采用圖像分析軟件Quantity One分別測定3組AIRE和β-actin的顯色條帶平均值，各組蛋白表達(dá)強(qiáng)度為二者平均值的比值。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR法 結(jié)果顯示C組AIRE mRNA含量明顯高于A、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A、B兩組之間含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1、圖1)。

2.2 蛋白免疫印跡法 結(jié)果顯示C組AIRE蛋白含量較A、B組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A、B兩組之間含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1、圖2)。

表1 AIRE基因及蛋白含量表達(dá)比較

*P<0.05,**P<0.05

圖1 3組胸腺內(nèi)AIRE mRNA表達(dá)電泳圖

圖2 蛋白免疫印跡法比較3組胸腺內(nèi)AIRE蛋白表達(dá)

3 討 論

AIRE蛋白是一種具有轉(zhuǎn)錄活化潛能的結(jié)合蛋白[6]，定位于細(xì)胞核中，分布在細(xì)胞核附近，與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，主要表達(dá)在胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞中(mTEC)，T細(xì)胞在胸腺發(fā)育過程中應(yīng)經(jīng)歷陰性選擇，以刪除自身反應(yīng)性細(xì)胞，通過此途徑而對自身抗原的中樞耐受，目前研究顯示[7]，AIRE蛋白對暴露這些自身抗原起著重要作用，AIRE蛋白表達(dá)于mTEC細(xì)胞后，誘導(dǎo)mTEC細(xì)胞表達(dá)組織相容性復(fù)合體(MHC)/人類白細(xì)胞抗原(HLA)，從而參與T細(xì)胞的選擇過程。研究已表明[8]95%的胸腺瘤與AIRE基因缺失有關(guān)，但AIRE基因與MG之間的關(guān)系研究較少。

MG是一種常見的發(fā)生在神經(jīng)肌肉接頭處的自身免疫性疾病，而約85%MG患者血清中可發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿受體抗體(AChR-ab)，還有多種其它類型的自身抗體如MuSK-ab、LRP4-ab[9]，這些自身抗體的產(chǎn)生是由于自身抗原中樞性耐受受損，MG患者胸腺內(nèi)T細(xì)胞發(fā)育異常，胸腺微環(huán)境是T細(xì)胞的發(fā)育的主要結(jié)構(gòu)，在胸腺內(nèi)陰性選擇過程中，AIRE起到重要作用，它控制調(diào)解性T細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)組織特異性抗原胸腺細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，參與自身免疫耐受形成，在敲除AIRE基因的小鼠中，可觀察到多種自身免疫疾病的發(fā)生。

MG和胸腺關(guān)系密切，MG患者多數(shù)伴有胸腺異常，本研究結(jié)果顯示，C組AIRE mRNA含量及蛋白含量均明顯高于A、B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A、B兩組之間含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。即MG患者胸腺瘤組、MG胸腺正常組中的AIRE的基因含量及蛋白含量較對照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組間比較胸腺異常組、胸腺正常組治療差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MG患者胸腺內(nèi)AIRE的含量較正常人降低，而與MG患者胸腺的病理類型無關(guān)，提示我們AIRE與MG的發(fā)病有關(guān)，MG是一種自身免疫性疾病，與胸腺內(nèi)T細(xì)胞選擇過程中自身抗原的刪除有關(guān)，MG患者胸腺內(nèi)AIRE表達(dá)減少時(shí)，神經(jīng)肌肉接頭處的自身抗原無法刪除，從而誘導(dǎo)了針對神經(jīng)肌肉接頭處的自身抗體，有研究表明AIRE參與胸腺內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)發(fā)育[10]，說明 AIRE在重癥肌無力發(fā)病過程的起始階段，即胸腺內(nèi)的自身抗原細(xì)胞刪除過程中有重要作用，為以后進(jìn)一步研究AIRE的作用提供一定的依據(jù)。

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Theexpressionandfunctionoftheautoimmuneregulator(AIRE)inthymuswithmyastheniagravispatients

YANBin,ZHUMingzhen,LIWeijun,etal.

(DepartmentofNeurology,PuyangPeople’sHospital,Puyang457000,China)

ObjectiveTo compare the content of autoimmune regulator (AIRE) in thymus with myasthenia gravis (MG) patients and the normal,then we analyze role of AIRE on the pathogenesis of MG.MethodsThe patients those have cardiac surgery with MG thymus tissue are collected in puyang city people’s hospital.These patients are divided into three groups,MG patients with thymoma group (A),MG patients with normal thymus group (B),the control group (C).Western blots method and fluorescence quantitative PCR method are used to compare thymus AIRE gene and protein content in the three groups.ResultsThe content of AIRE gene in C group(0.75±0.04) is obviously higher than that of A(0.42±0.08),B(0.45±0.08)groups,the difference is statistically significant(P<0.05).The content of AIRE gene in the A,B groups has no statistical significance (P>0.05).The content of AIRE protein in C(0.72±0.05)group is obviously higher than that of A(0.40±0.08),B(0.50±0.05)groups,the difference is statistically significant(P<0.05).The content of AIRE protein in the A,B groups has no statistical significance(P>0.05).ConclusionThe content of AIRE gene and the protein in MG patients with thymus is lower than the control group,and has nothing to do with thymus pathological type.The AIRE plays an important role on the pathogenesis of MG.

Autoimmune regulator; Myasthenia gravis

R746.1

A

1003-2754(2017)10-0913-03

2017-06-03；

2017-09-28

( 1.河南省濮陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 濮陽 457000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

賈麗景，E-mail:jij997@126.com