黃勇，張鐵，劉偉

（云南省文山學(xué)院，云南文山663099）

“柳城05136號”甘蔗脫毒培養(yǎng)

黃勇，張鐵，劉偉

（云南省文山學(xué)院，云南文山663099）

以“柳城05136號”甘蔗為材料，通過預(yù)處理與脫毒培養(yǎng)，旨在建立起“柳城05136號”甘蔗健康種苗繁育體系。結(jié)果表明：經(jīng)預(yù)處理，莖段腋芽萌發(fā)率達(dá)94%。莖尖在MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0g/L培養(yǎng)基中生長良好。在增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0mg/L+KT 0.5mg/L中增殖系數(shù)達(dá)15.2。在生根培養(yǎng)基MS+NAA 1.0mg/L中，生根率達(dá)95%。經(jīng)煉苗移栽存活率為92%。由此，建立了“柳城05136號”甘蔗健康種苗繁育體系，豐富了甘蔗健康種苗生物多樣性。

甘蔗；“柳城05136號”；脫毒培養(yǎng)

甘蔗 （Saccharum officinarumLinn） 為禾本科（Gramineae）甘蔗屬（Saccharum）植物，我國南方熱帶地區(qū)廣泛種植[1]。由于長期無性繁殖，病毒病嚴(yán)重危害，導(dǎo)致甘蔗品種退化、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣。采用傳統(tǒng)的物理、化學(xué)及生物等方法來防治病毒病收效甚微。熱處理可鈍化病毒，莖尖培養(yǎng)更是生產(chǎn)無病毒種苗的有效途徑[2]。將兩者結(jié)合起來可以除去甘蔗花葉病、宿根矮化病等病害，生產(chǎn)健康種苗[3-8]。巴西、古巴、美國、澳大利亞等世界甘蔗生產(chǎn)大國蔗區(qū)均使用健康種苗。如巴西使用甘蔗健康種苗，產(chǎn)量提高20%～40%，含糖量提高0.5%以上[9]。健康種苗對甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要，而我國在甘蔗生產(chǎn)上只有少數(shù)地區(qū)使用健康種苗，而且品種單一，僅有脫毒“新臺糖22號”。有關(guān)“柳城05136號”健康種苗的研究國內(nèi)外鮮見報道。本試驗(yàn)通過對“柳城05136號”進(jìn)行預(yù)處理和脫毒培養(yǎng)，希望建立“柳城05136號”甘蔗健康種苗繁育體系，豐富健康種苗的多樣性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將“柳城05136號”甘蔗切成帶腋芽的莖段作為試驗(yàn)材料。

1.2 材料預(yù)處理

1.2.1 溫湯浸種

甘蔗莖段放入50℃恒溫水浴鍋中溫湯浸種15min。

1.2.2 恒溫培養(yǎng)

恒溫培養(yǎng)箱中放置育苗盤，育苗盤上平鋪一層濕潤的毛巾。甘蔗莖段兩端蘸取殺菌劑后橫放在濕毛巾上。腋芽生長點(diǎn)朝上，如圖1所示。莖段上方再平鋪一層濕毛巾。培養(yǎng)溫度為35℃、相對濕度為80%、光照強(qiáng)度為1000lx，觀察腋芽萌發(fā)情況。

圖1 甘蔗腋芽培養(yǎng)方式

1.2.3 消毒處理

待甘蔗莖段腋芽萌發(fā)后即揭掉上層濕潤毛巾。腋芽長到2cm左右時，將腋芽帶少量莖切下進(jìn)行消毒。75%酒精消毒1min后用無菌水沖洗3次。0.1%HgCl2消毒25 min后用無菌水沖洗5次。

1.3 脫毒培養(yǎng)

1.3.1 莖尖生長

剝?nèi)∏o尖接種到以MS為基本培養(yǎng)基、6-BA（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、2,4-D（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、AC 3.0g/L、蔗糖（30g/L）、瓊脂（7g/L）的莖尖生長培養(yǎng)基上。共16個處理，每處理接種8瓶，每瓶接種5個莖尖。培養(yǎng)條件為溫度25℃、光照強(qiáng)度2000lx，觀察莖尖生長情況。

1.3.2 增殖培養(yǎng)

等到莖尖長到3cm左右時，轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0mg/L），KT （0.1、0.2、0.5、1.0mg/L）， 蔗 糖（30g/L），瓊脂（7g/L）。共16個處理，每個處理接種12瓶，每瓶接種3個外植體。培養(yǎng)條件為溫度28℃、光照強(qiáng)度3000lx。觀察生長情況。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析[10]。

1.3.3 生根培養(yǎng)

無根苗轉(zhuǎn)到以 MS為基本培養(yǎng)基、NAA（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、蔗糖（30g/L）、瓊脂（7g/L）的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。共4個處理，每個處理接種5瓶，每瓶接種8棵無根苗。培養(yǎng)在溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx條件下，觀察生根情況。

1.4 煉苗移栽

將甘蔗苗移至室外陰涼處放置1d，擰松瓶蓋放置1d，揭除瓶蓋放置1d。取出甘蔗苗，將附著在根部的培養(yǎng)基洗凈，殺菌劑消毒，種植在溫室中。

初期應(yīng)設(shè)置遮陽網(wǎng)，防止暴曬。到中期時撤除遮陽網(wǎng)。加強(qiáng)溫度、水分、營養(yǎng)管理，使甘蔗種苗逐步適應(yīng)自然條件。

1.5 病害檢測

參照李利君等（2000）[11]和 Clyn James（1997）[12]的方法對“柳城05136號”甘蔗種苗進(jìn)行花葉病和宿根矮化病的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 腋芽萌發(fā)

通過溫湯浸種與恒溫培養(yǎng)，“柳城05136號”甘蔗腋芽萌發(fā)率為94%，到7d左右時生長到2cm左右。如圖2所示。此法打破腋芽休眠，不受季節(jié)限制，可隨時取材進(jìn)行甘蔗脫毒培養(yǎng)。

圖2 預(yù)處理后腋芽萌發(fā)情況

2.2 莖尖生長情況

在不同6-BA與2,4-D濃度組合的培養(yǎng)基中，莖尖生長情況有所不同。其中，在MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0g/L中，莖尖的生長速度快、畸形苗少，是較適宜的莖尖生長培養(yǎng)基，如圖3所示。當(dāng)6-BA和2,4-D的濃度過高時畸形苗多，且形成大量愈傷組織，莖尖無法正常生長；濃度過低莖尖生長慢或不生長。

圖3 在適宜培養(yǎng)基中甘蔗莖尖生長情況

2.3 增殖系數(shù)

在不同的增殖培養(yǎng)基中，增殖系數(shù)高低不一。對其進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表1所示。

從表 1 可以看出，對于 6-BA 來說，k2＞k3＞k1＞k4，即當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L時增殖系數(shù)最高，平均為11.7。對于 KT來說，k3＞k2=k4＞k1，即當(dāng) KT濃度為 0.5mg/L時增殖系數(shù)最高，平均為9.6。從極差R來看，6-BA＞KT，說明6-BA對甘蔗增殖系數(shù)的影響大于KT。處理7最優(yōu)，即“柳城05136號”甘蔗在增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0mg/L+KT0.5mg/L中增殖系數(shù)最高，達(dá)15.2。

用SPSS軟件對甘蔗增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，6-BA和KT對“柳城05136號”甘蔗增殖系數(shù)均有極顯著的影響，且二者之間還存在極顯著的交互作用。說明適宜濃度的6-BA和KT搭配使用，對“柳城05136號”甘蔗的增殖起著至關(guān)重要的作用。

2.4 生根情況

無根苗在不同的生根培養(yǎng)基中生長情況有差異。其中，在MS+NAA1.0mg/L中，生根率最高，達(dá)95%，且根多而長，如圖4所示。

圖4 甘蔗在適宜培養(yǎng)基中生根情況

2.5 移栽存活率

煉苗移栽后，“柳城05136號”甘蔗種苗生長正常，存活率達(dá)92%。

2.6 病害檢測結(jié)果

經(jīng)檢測，種苗脫去了花葉病和宿根矮化病，從而繁育出“柳城05136號”甘蔗健康種苗。由于在培養(yǎng)的植株中許多病毒具有延遲的恢復(fù)期，所以在最初18個月中每隔一定時間需進(jìn)行鑒定。而且無病毒植株容易再被感染，因此在繁殖的不同時期仍需重復(fù)進(jìn)行鑒定。只有對待定的病毒顯示持續(xù)陰性反應(yīng)的無病毒植株才能進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖[2]?！傲?5136號”甘蔗健康種苗在田間是否具有抗花葉病和宿根矮化病特性有待進(jìn)一步的大田試驗(yàn)。

3 討論

世界甘蔗生產(chǎn)大國在生產(chǎn)上已普遍使用健康種苗，而我國只有部分地區(qū)使用健康種苗，而且品種比較單一，對我國甘蔗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展不利。本試驗(yàn)通過材料預(yù)處理與脫毒培養(yǎng)，建立了“柳城05136號”甘蔗健康種苗的繁育體系，豐富了甘蔗健康種苗的生物多樣性。在生產(chǎn)中是否始終具有花葉病與宿根矮化病抗性，是否能發(fā)揮甘蔗健康種苗高產(chǎn)、高糖的“雙高”優(yōu)勢，有待進(jìn)一步的大田試驗(yàn)。

表1 “柳城05136號”甘蔗增殖系數(shù)極差分析表

表2 “柳城05136號”甘蔗增殖系數(shù)方差分析表因變量：增殖系數(shù)

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Virus-free Culture of Sugarcane"Liucheng No.05136"

HUANG Yong,ZHANG Tie,LIU Wei
(Wenshan University of Yunnan Province,Wenshan 663099,China)

It aimd at building a breeding system of healthy seedling of sugarcane of"Liucheng No.05136"by pretreating and virus-free culture.The result showed that germination rate of lateral bud was 94%after pretreating.Stem tip growed well in the medium of MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0mg/L.Multiplication rate was 15.2 in the subculture medium of MS+6-BA 2.0mg/L+KT 0.5mg/L.Rooting rate was high to 95%in the rooting medium of MS+NAA 1.0mg/L.Survival rate was 92%after acclimatizing and transplanting.A breeding system of healthy seedling for"Liucheng No.05136"was built up.Biodiversity of healthy seedling of sugarcane was enriched.

Sugarcane;"Liucheng No.05136";virus-free culture

S566.1

A

1008-1038(2017)10-0070-04

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.10.021

2017-08-02

云南省教育廳科學(xué)研究基金項目（2012Y269）；文山學(xué)院科學(xué)研究基金項目（13WSY06）；文山州科技計劃項目

黃勇（1981—），男，講師，主要從事植物資源開發(fā)工作