楊佳 李黎明 許翠 龍嘉 王堯 楊雪源 蔣明軍

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所中心實(shí)驗(yàn)室 江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（楊佳、李黎明、許翠、龍嘉、楊雪源、蔣明軍）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)基地班（王堯）

·論著·

慢病毒介導(dǎo)的靶向沉默HPV16 E7?shRNA對(duì)SiHa細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

楊佳 李黎明 許翠 龍嘉 王堯 楊雪源 蔣明軍

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所中心實(shí)驗(yàn)室 江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（楊佳、李黎明、許翠、龍嘉、楊雪源、蔣明軍）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)基地班（王堯）

目的 探討慢病毒攜帶的靶向人乳頭瘤病毒16（HPV16）E7基因的短發(fā)夾干擾RNA（shRNA）對(duì)HPV16陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞中4種甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L）表達(dá)水平的影響。方法 構(gòu)建HPV16 E7基因靶序列的shRNA重組質(zhì)粒，用BLOCK?iT?Lentiviral RNAi Expression System試劑盒進(jìn)行慢病毒包裝，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48、72 h后收集病毒上清液。分別用含靶向HPV16 E7?shRNA重組質(zhì)粒的病毒上清液與完全培養(yǎng)基（1∶1）的混合液（shRNA組）、含空白質(zhì)粒（即不含靶向HPV16 E7?shRNA序列）的病毒上清液與完全培養(yǎng)基（1∶1）的混合液（陰性對(duì)照組）、完全培養(yǎng)基（空白對(duì)照組）培養(yǎng)SiHa細(xì)胞。感染0、48、96 h后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測(cè)3組SiHa細(xì)胞中HPV16 E7和4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA的表達(dá)，Western印跡檢測(cè)4種甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白表達(dá)。結(jié)果 感染0 h時(shí)，shRNA組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組SiHa細(xì)胞HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；感染48、96 h時(shí)，3組細(xì)胞間HPV16 E7和4種DNMT mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。shRNA組HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA表達(dá)水平在48 h時(shí)的沉默效率分別為71.13%、50.53%、13.72%、46.27%和17.92%，96 h時(shí)分別為83.50%、74.2%、47.8%、64.7%和48.9%；而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。慢病毒感染48、96 h時(shí)，3組細(xì)胞間上述4種DNMT蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。shRNA組4種DNMT蛋白表達(dá)水平隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，感染48 h時(shí)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L蛋白表達(dá)抑制率分別為84%、37.2%、59.8%、49.3%，96 h時(shí)分別為73.1%、68.7%，55.5%、65.5%。結(jié)論 靶向沉默HPV16陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞E7基因能夠干擾DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA及蛋白的表達(dá)。

人乳頭瘤病毒16；乳頭瘤病毒E7蛋白質(zhì)類(lèi)；RNA，小分子干擾；甲基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)；細(xì)胞系，腫瘤

近年來(lái)，多種研究提示，表觀遺傳學(xué)改變參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最為深入的一種機(jī)制［1］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）是催化DNA異常甲基化過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)分子，其表達(dá)水平和功能改變是導(dǎo)致異常DNA甲基化模式的重要因素之一［2］。Burgers等［3］的研究表明，人乳頭瘤病毒16（HPV16）E7可與DNMT1直接結(jié)合，從而激活DNMT1。高危型HPV感染和DNA異常甲基化均參與相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，我們推測(cè)，HPV16可能通過(guò)E7蛋白與DNMT發(fā)生作用，引起DNA異常甲基化，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)目的基因表達(dá)和功能發(fā)生改變。本研究以HPV16 E7為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾序列，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體，對(duì)病毒進(jìn)行包裝，提取病毒液感染HPV16陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞，探討體外靶向沉默HPV16 E7基因?qū)NMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的影響。

材料與方法

一、試劑與材料

SiHa和293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol試劑和慢病毒包裝系統(tǒng)（BLOCK?iTTMLentiviral RNAi Expression System Kit）（美國(guó)Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Quanti Fast SYBR Green PCR試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶和opti?MEM無(wú)血清培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），人DNMT1、DNMT3A、β肌動(dòng)蛋白抗體、蛋白顯影液 20×LumiGLO?Reagent and 20× Peroxide（美國(guó)CST公司），人DNMT3B、DNMT3L抗體（英國(guó)Abcam公司）。

二、方法

1.HPV16 E7基因shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)基因庫(kù)提供的HPV16 E7基因序列，按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，通過(guò)BLOCK?iT RNAi Designer在線設(shè)計(jì)軟件（http：∕∕rnaidesigner.thermofisher.com∕rnaiexpress∕design.do）選擇長(zhǎng)19個(gè)堿基的HPV16 E7基因特異性寡核苷酸序列為干擾靶點(diǎn)，靶序列如下：5′?AGGAGGATGAAATAGATGG?3′，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成針對(duì)上述HPV16 E7基因靶序列的shRNA重組質(zhì)粒（pLenti6∕BLOCK?iT?DEST expression plasmid）。

2.慢病毒包裝：轉(zhuǎn)染前24 h，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，胰酶消化后傳代接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)60%～70%后用于轉(zhuǎn)染。慢病毒包裝操作流程參考慢病毒包裝系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)，將制成的DNA?脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入293T細(xì)胞，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，更換為含10%胎牛血清（FBS）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h收獲含病毒的上清液，4℃、1 409×g離心15 min去除細(xì)胞碎片，病毒液分裝后-80℃凍存。

3.慢病毒感染SiHa細(xì)胞：用胰酶消化SiHa細(xì)胞后，以1.5×105個(gè)細(xì)胞∕孔接種于6孔培養(yǎng)板中，次日將培養(yǎng)液換成病毒液和完全培養(yǎng)基混合液（1∶1）2 ml進(jìn)行病毒感染。實(shí)驗(yàn)分為shRNA組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組：①shRNA組：含靶向HPV16 E7?shRNA重組質(zhì)粒的病毒液培養(yǎng)SiHa細(xì)胞；②陰性對(duì)照組：含空白質(zhì)粒（即不含靶向HPV16 E7?shRNA序列）的病毒液培養(yǎng)SiHa細(xì)胞；③空白對(duì)照組：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SiHa細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測(cè)HPV16 E7及4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA的表達(dá)情況：分別收集感染0、48、96 h的細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)流程將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用Quanti Fast SYBR Green PCR試劑盒按其說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系如下：cDNA模板1 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl及去離子水8 μl，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件如下：50℃2 min；95℃5 min；95℃20 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃1 min，95℃15 s。根據(jù)所得的Ct值，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，ΔCt=待測(cè)基因Ct-β肌動(dòng)蛋白Ct；ΔΔCt=感染組ΔCt-空白對(duì)照組ΔCt，計(jì)算2?ΔΔCt，得到感染組樣本待測(cè)基因相對(duì)于空白對(duì)照組樣本基因的相對(duì)表達(dá)量。DNMT基因沉默效率=［1-（感染后甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA∕感染前甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA）］×100%。

表1 待測(cè)基因及內(nèi)參照的引物序列

5.Western印跡測(cè)定4種甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白表達(dá)：分別于感染0、48、96 h后收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg總蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，分別加入兔抗人DNMT1（1∶1 000）、DNMT3A（1∶1 000）、DNMT3B（1∶2 000）、DNMT3L（1∶2 000）抗體及兔抗人β肌動(dòng)蛋白（1∶1 000）抗體4℃孵育過(guò)夜。TBST液洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST液洗膜，用20×LumiGLO?Reagent and 20×Peroxide發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光獲取圖像，用Quantity one軟件對(duì)各個(gè)條帶進(jìn)行灰度值觀察。待測(cè)蛋白表達(dá)量=待測(cè)蛋白條帶灰度值∕β肌動(dòng)蛋白條帶灰度值。DNMT蛋白表達(dá)抑制率=［1-（感染后DNMT蛋白表達(dá)量∕感染前DNMT蛋白表達(dá)量）］×100%。

結(jié)果

一、各組SiHa細(xì)胞HPV16 E7 mRNA水平

表2 慢病毒感染SiHa細(xì)胞3組間HPV16 E7 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 慢病毒感染SiHa細(xì)胞3組間HPV16 E7 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：n=3。時(shí)間主效應(yīng)F=10.70，P＜0.01；組間主效應(yīng)F=22.01，P＜0.01；交互效應(yīng)F=6.15，P＜0.01

組別shRNA組陰性對(duì)照組空白對(duì)照組F值P值0 h 0.97±0.04 0.96±0.02 0.98±0.05 0.07＞0.05 48 h 0.28±0.09 0.98±0.05 0.95±0.03 152.08＜0.05 96 h 0.16±0.08 0.93±0.08 0.96±0.05 287.85＜0.05 F值149.20 1.06 0.22 P值＜0.05＞0.05＞0.05

見(jiàn)表2。經(jīng)多因素方差分析，3組細(xì)胞間HPV16 E7 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.01，P＜0.01），各組HPV16 E7 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而降低（F=10.70，P＜0.01），時(shí)間與組別間存在交互作用（F=6.15，P＜0.01）。感染0 h時(shí)，3組細(xì)胞間HPV16 E7 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而感染48、96 h時(shí)，3組細(xì)胞間HPV16 E7 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。shRNA組HPV16 E7 mRNA表達(dá)水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低（P＜0.05），48、96 h時(shí)的沉默效率分別為71.13%、83.50%，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)HPV16 E7 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

二、HPV16 E7表達(dá)水平變化對(duì)SiHa細(xì)胞4種mRNA和蛋白的表達(dá)

1.經(jīng)多因素方差分析，3組細(xì)胞間DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、 DNMT3L mRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為294.80、52.50、214.73、77.40，均 P＜0.01）。各組細(xì)胞4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA相對(duì)表達(dá)量有隨感染時(shí)間變化的趨勢(shì)（F值分別為90.94、25.50、72.76、31.04，均P＜0.01），時(shí)間與組別均存在交互作用（F值分別為78.82、19.93、57.22、22.74，均P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 慢病毒感染SiHa細(xì)胞后各組4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）mRNA表達(dá)情況 shRNA組4種DNMT mRNA相對(duì)表達(dá)量均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組未見(jiàn)明顯變化

慢病毒感染SiHa細(xì)胞0 h時(shí)，3組細(xì)胞間4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為0.16、0.33、0.27、0.11，均P＞0.05）；感染48、96 h時(shí)，3組細(xì)胞間4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。此外，shRNA組上述4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降（均P＜0.01），感染48、96 h時(shí)4種DNMT的沉默效率分別為50.53%、74.2%，13.72%、47.8%，46.27%、64.7%，17.92%、48.9%。然而，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖2 Western印跡法檢測(cè)感染48、96 h后3組SiHa細(xì)胞4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）蛋白的表達(dá) 1：shRNA組；2：陰性對(duì)照組；3：空白對(duì)照組。感染48、96 h時(shí)，shRNA組4種蛋白表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間無(wú)明顯差異；此外，shRNA組4種DNMT蛋白表達(dá)水平隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降

表3 慢病毒感染48、96 h后3組SiHa細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）蛋白表達(dá)（±s）

表3 慢病毒感染48、96 h后3組SiHa細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）蛋白表達(dá)（±s）

注：n=3

組別shRNA組陰性對(duì)照組空白對(duì)照組DNMT1 48 h 0.08±0.05 0.54±0.04 0.50±0.06 96 h 0.07±0.01 0.29±0.03 0.26±0.05 DNMT3A 48 h 0.27±0.02 0.41±0.01 0.43±0.02 96 h 0.10±0.02 0.36±0.05 0.32±0.06 DNMT3B 48 h 0.37±0.06 0.92±0.04 0.92±0.06 96 h 0.20±0.02 0.50±0.05 0.45±0.05 DNMT3L 48 h 0.37±0.06 0.66±0.02 0.73±0.06 96 h 0.23±0.03 0.80±0.03 0.67±0.05

2.蛋白表達(dá)水平變化：見(jiàn)圖2，表3。經(jīng)多因素方差分析，3組細(xì)胞間4種DNMT蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為140.57、61.25、143.84、184.43，均P＜0.01），且各組細(xì)胞4種DNMT蛋白表達(dá)量有隨感染時(shí)間變化的趨勢(shì)（F值分別為98.28、 41.89、230.83、51.56，均P＜0.01），時(shí)間與組別間存在交互作用（F值分別為22.05、4.67、14.255、16.34，均P＜0.05）。感染48 h時(shí)4種DNMT蛋白表達(dá)抑制率分別為84%、37.2%、59.8%、49.3%，96 h時(shí)為73.1%、68.7%，55.5%、65.5%。

討論

流行病學(xué)和分子生物學(xué)資料［4］表明，高危型HPV持續(xù)感染兩性生殖器部位皮膚黏膜易導(dǎo)致陰莖癌、女性外陰癌和宮頸癌，以高危型HPV16最為常見(jiàn)，其基因組基本結(jié)構(gòu)分為3個(gè)功能區(qū)：早期轉(zhuǎn)錄區(qū)（E1、E2、E4、E5、E6、E7），晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)（L1、L2）和非轉(zhuǎn)錄區(qū)（LCR）。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼的基因主要參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等功能，其中E7基因編碼的蛋白可導(dǎo)致多種細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控信號(hào)失效，如pRb介導(dǎo)的生長(zhǎng)停滯、p16介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯等［5］。有學(xué)者［6］研究發(fā)現(xiàn)，E7蛋白能夠通過(guò)激活EZH2基因表達(dá)增強(qiáng)DNMT的活性，表明HPV16 E7與DNA甲基化狀態(tài)有密切聯(lián)系。

DNMT是催化DNA異常甲基化過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)分子，其表達(dá)水平和功能的改變是導(dǎo)致異常DNA甲基化模式的重要內(nèi)源性因素，主要包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L。DNMT1是DNA進(jìn)行復(fù)制并維持其正常甲基化的關(guān)鍵酶，DNMT3A和DNMT3B主要催化從頭甲基化，DNMT3L并沒(méi)有直接的甲基化作用，但可以通過(guò)蛋白之間的相互作用調(diào)節(jié)DNMT3A和DNMT3B的活性［7］。有研究表明，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達(dá)水平在宮頸癌組織中高于正常宮頸組織，提示DNMT表達(dá)異常是引起宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素［8?9］。Au Yeung等［10］通過(guò)RNAi技術(shù)沉默宮頸癌細(xì)胞株中HPV16 E6基因后，觀察到DNMT1蛋白表達(dá)水平下降，而過(guò)表達(dá)E6基因，DNMT1蛋白表達(dá)水平隨之上升，提示HPV16 E6癌基因參與調(diào)節(jié)宮頸癌中DNMT的表達(dá)。Burgers等［3］研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 E7可通過(guò)與DNMT1直接結(jié)合，形成E7∕DNMT1復(fù)合物，活化DNMT1，促進(jìn)DNMT1與DNA和腺苷蛋氨酸結(jié)合，這是迄今為止唯一明確證實(shí)E7和DNMT有直接結(jié)合，進(jìn)而激活酶活性的研究報(bào)道。

本研究選擇HPV16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞株SiHa，應(yīng)用靶向HPV16 E7的shRNA慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，選擇性抑制細(xì)胞內(nèi)HPV16編碼的E7基因表達(dá)，并分別采用qRT?PCR和Western印跡法對(duì)E7蛋白及4種DNMT在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達(dá)情況進(jìn)行分析，從而探索4種DNMT表達(dá)水平與HPV16 E7蛋白的依賴(lài)關(guān)系。數(shù)據(jù)表明，在慢病毒感染SiHa細(xì)胞48、96 h后，HPV16 E7 mRNA表達(dá)水平較感染前顯著下降，提示靶向HPV16 E7干擾慢病毒構(gòu)建成功，該慢病毒能夠有效且特異地沉默E7基因，抑制其在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，在感染前3組細(xì)胞間4種甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平均無(wú)明顯差異，感染48、96 h時(shí)，shRNA組4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA和蛋白表達(dá)水平均逐漸下降。提示在SiHa細(xì)胞中，HPV16 E7基因可能通過(guò)某種直接或間接的機(jī)制參與調(diào)控DNMT的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)改變，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。該研究為深入研究E7基因與DNMT的相互作用關(guān)系提供了依據(jù)。

［1］Dawson MA,Kouzarides T.Cancer epigenetics:from mechanism to therapy［J］.Cell,2012,150（1）:12?27.DOI:10.1016∕j. cell.2012.06.013.

［2］Ehrlich M.DNA hypomethylation in cancer cells［J］.Epigenomics, 2009,1（2）:239?259.DOI:10.2217∕epi.09.33.

［3］Burgers WA,Blanchon L,Pradhan S,et al.Viral oncoproteins target the DNA methyltransferases［J］.Oncogene,2007,26（11）: 1650?1655.DOI:10.1038∕sj.onc.1209950.

［4］PettM,ColemanN.Integrationofhigh?riskhumanpapillomavirus:a key event in cervical carcinogenesis［J］.J Pathol,2007,212（4）: 356?367.DOI:10.1002∕path.2192.

［5］Riley RR,Duensing S,Brake T,et al.Dissection of human papillo?mavirus E6 and E7 function in transgenic mouse models of cervical carcinogenesis［J］.CancerRes,2003,63（16）:4862?4871.

［6］Holland D,Hoppe?Seyler K,Schuller B,et al.Activation of the enhancer of zeste homologue 2 gene by the human papillomavirus E7 oncoprotein［J］.Cancer Res,2008,68（23）:9964?9972.DOI: 10.1158∕0008?5472.CAN?08?1134.

［7］Van Emburgh BO,Robertson KD.Modulation of Dnmt3b function in vitro by interactions with Dnmt3L,Dnmt3a and Dnmt3b splice variants［J］.Nucleic Acids Res,2011,39（12）:4984?5002.DOI: 10.1093∕nar∕gkr116.

［8］Robertson KD,Uzvolgyi E,Liang G,et al.The human DNA methyltransferases（DNMTs）1,3a and 3b:coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors［J］. Nucleic Acids Res,1999,27（11）:2291?2298.DOI:10.1093∕nar∕27.11.2291.

［9］黃團(tuán)明,王婉,閆曉歡,等.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與HPV的相關(guān)性分析［J］.重慶醫(yī)學(xué),2015,44（13）: 1752?1755.DOI:10.3969∕j.issn.1671?8348.2015.13.009.

［10］Au Yeung CL,Tsang WP,Tsang TY,et al.HPV?16 E6 upregula?tion of DNMT1 through repression of tumor suppressor p53［J］. Oncol Rep,2010,24（6）:1599?1604.DOI:10.3892∕or_00001023.

Effects of lentivirus?delivered short hairpin RNA targeting human papillomavirus 16 E7 gene on the expression of DNA methyltransferases in SiHa cells

Yang Jia,Li Liming,Xu Cui,Long Jia,Wang Yao,Yang Xueyuan,Jiang Mingjun
Central Laboratory,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042, China（Yang J,Li LM,Xu C,Long J,Yang XY,Jiang MJ）;Life Sciences and Technology Base Class, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China（Wang Y）

Jiang Mingjun,Email:drmingjunjiang@163.com

Objective To evaluate the effects of lentivirus?delivered short hairpin RNA（shRNA）targeting human papillomavirus 16（HPV16）E7 gene on the expression of 4 kinds of DNA methyl?transferases（DNMTs）,including DNMT1,DNMT3A,DNMT3B and DNMT3L,in HPV16?positive cervical cancer cell line SiHa.Methods The recombinant plasmid containing HPV16 E7 gene?targeting shRNA was constructed firstly.Then,the BLOCK?iTTM lentiviral RNAi expression system kit was used to package the lentiviral vector,which was transfected into 293T cells.The lentivirus?containing supernatants were collected at 48 and 72 hours after transfection.The SiHa cells were divided into 3 groups to be cultured with lentiviral supernatant containing HPV16 E7 gene?targeting shRNA recombinant plasmids mixed with complete medium at a ratio of 1∶1（shRNA group）,lentiviral supernatant containing empty plasmids mixed with complete medium at a ratio of 1∶1（negative control group）,and complete medium alone（blank control group）,respectively.Real?time fluorescence?based quantitative PCR（qRT?PCR）was performed to measure mRNA expression of HPV16 E7 and 4 kinds of DNMTs in the above 3 groups at 0,48,96 hours after infection,and Western blot analysis to determine protein expression of the 4 DNMTs at 48,96 hours after infection.Results There were no significant differences in the mRNA expression of HPV16 E7 and the 4 DNMTs among the shRNA group,negative control group and blank control group at 0 hour after infection（all P＞0.05）.At 48,96 hours after infection,the mRNA expression of HPV16 E7 and the 4 DNMTs decreased significantly in the shRNA group compared with the negative control group and blank control group（all P＜0.05）,but did not differ between the negative control group and blank control group（all P＞0.05）.Additionally,E7,DNMT1,DNMT3A,DNMT3B and DNMT3L gene?silencing efficiencies in the shRNA group were 71.13%,50.53%,13.72%,46.27%and 17.92%at 48 hours,and 83.50%,74.2%, 47.8%,64.7%and 48.9%at 96 hours after infection,respectively.Western blot analysis showed that the protein expression of the 4 DNMTs significantly decreased in the shRNA group compared with the negative control group and blank control group at 48,96 hours after infection（all P＜0.01）.Moreover,the protein expression of DNMT1,DNMT3A,DNMT3B and DNMT3L in the shRNA group gradually decreased over time,and was inhibited by 84%,37.2%,59.8%and 49.3%at 48 hours respectively,and by 73.1%,68.7%, 55.5%and 65.5%at 96 hours after infection respectively.Conclusion Targeted silencing of E7 gene in HPV16?positive SiHa cells can interfere with the mRNA and protein expression of DNMT1,DNMT3A, DNMT3B and DNMT3L.

Human papillomavirus 16;Papillomavirus E7 proteins;RNA,small interfering;Methyl?transferases;Cell line,tumor

蔣明軍，Email：drmingjunjiang@163.com

10.3760∕cma.j.issn.0412?4030.2017.02.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（31470274）；江蘇省臨床醫(yī)學(xué)研究中心項(xiàng)目（BL2012003）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2016RC310025）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31470274）;Clinical Research Center Program of Jiangsu Province（BL2012003）;Special Fund for Basic Scientific Research Business of Central Public Research Institutes（2016RC310025）

2015?12?28）

（本文編輯：周良佳 顏艷）