王海濤 姜仁軍 李樹偉

843300新疆阿拉爾，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

·論著·

胎鼠皮膚無瘢痕愈合培養(yǎng)液優(yōu)化及皮膚細(xì)胞增殖活躍區(qū)研究

王海濤 姜仁軍 李樹偉

843300新疆阿拉爾，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

目的 優(yōu)化昆明遠(yuǎn)交系（KM）胎鼠皮膚無瘢痕愈合模型的培養(yǎng)液，定位并分析皮膚創(chuàng)傷愈合中細(xì)胞增殖活躍區(qū)。方法 取60只胎齡15 d小鼠背部皮片180塊，用無菌微創(chuàng)器在皮片上統(tǒng)一造創(chuàng)，隨機(jī)等分到6組培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，包括高糖改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）組、DMEM+5%胎牛血清（FBS）組、DMEM+10%FBS組、低糖Eagle培養(yǎng)基（MEM）組、MEM+5%FBS組、MEM+10%FBS組。HE染色后觀察各組皮膚創(chuàng)口愈合情況，篩選最適培養(yǎng)條件。在最適培養(yǎng)條件下采用EdU細(xì)胞標(biāo)記物定位皮膚創(chuàng)口愈合處細(xì)胞增殖活躍區(qū)，并用免疫熒光檢測其中AP?1蛋白表達(dá)。結(jié)果 胎鼠微創(chuàng)皮片培養(yǎng)3 d后，DMEM組、DMEM+5%FBS組、DMEM+10%FBS組、MEM組、MEM+5%FBS組、MEM+10%FBS組皮片愈合率分別為0、3.33%、6.67%、3.33%、46.67%、26.67%，6組皮片愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=41.39，P＜0.05）。兩兩比較顯示，MEM+5%FBS組皮片愈合率顯著高于除MEM+ 10%FBS組外的其他4組（均P＜0.01）。logistic回歸分析顯示，MEM（OR=11.717，95%CI 3.274～41.934，P＜0.001）及FBS濃度（5%FBS：OR=24.625，95%CI 3.027～200.299，P=0.003；10%FBS：OR=13.449，95%CI 1.618～111.813，P=0.016）均是促進(jìn)胎鼠微創(chuàng)皮片愈合的因素。在MEM+5% FBS培養(yǎng)條件下，真皮和表皮愈合形態(tài)最好，且創(chuàng)面處表皮無增厚現(xiàn)象。EdU細(xì)胞增殖標(biāo)記分析顯示，胎鼠皮膚的真皮乳頭層和表皮基底層是創(chuàng)面愈合過程中兩個(gè)主要的細(xì)胞增殖活躍區(qū)，同時(shí)AP?1蛋白在這兩個(gè)細(xì)胞增殖活躍區(qū)也有大量表達(dá)。結(jié)論 MEM+5%FBS為體外培養(yǎng)胎鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的最適培養(yǎng)液。胎鼠皮膚的真皮乳頭層和表皮基底層是皮膚創(chuàng)傷愈合中兩個(gè)主要的細(xì)胞增殖活躍區(qū)，在創(chuàng)面愈合過程中起到重要作用。

傷口愈合；瘢痕；轉(zhuǎn)錄因子AP?1；無瘢痕愈合；胎鼠

無瘢痕愈合作為機(jī)體創(chuàng)傷后最理想的愈合方式，其發(fā)生機(jī)制一直未闡明。到目前為止，關(guān)于胚胎皮膚無瘢痕愈合機(jī)制的研究主要以體內(nèi)為主，并未成功建立體外無瘢痕愈合模型來進(jìn)行該機(jī)制的研究。激活蛋白1（activator protein?1，AP?1）作為細(xì)胞核中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與細(xì)胞凋亡，也參與介導(dǎo)干細(xì)胞的增殖和分化［1］。AP?1蛋白的激活受很多因素調(diào)控，針對不同的組織細(xì)胞，AP?1蛋白可以激活相應(yīng)的基因表達(dá)，參與介導(dǎo)該組織細(xì)胞的增殖和分化等細(xì)胞生理功能［2?3］。但在胎鼠創(chuàng)面愈合過程中，AP?1蛋白是否表達(dá)，同時(shí)胚胎皮膚創(chuàng)面無瘢痕愈合機(jī)制是否與AP?1的表達(dá)有關(guān)尚不清楚。本研究利用不同類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)液和不同濃度的胎牛血清進(jìn)行配比，篩選優(yōu)化胎鼠皮膚無瘢痕愈合模型的體外培養(yǎng)液，并使用細(xì)胞增殖標(biāo)記物5?乙炔基?2′?脫氧尿苷（EdU）熒光定位皮膚生長代謝活躍區(qū)，對AP?1蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定，為后期建立胎鼠皮膚人工微創(chuàng)體外愈合模型奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為研究胚胎皮膚無瘢痕愈合機(jī)制提供新的思路。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

兔抗小鼠AP?1一抗（美國Amresco公司），異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的二抗、基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM（高糖改良Eagle培養(yǎng)基）和MEM（低糖Eagle培養(yǎng)基）（美國Gibco公司），青∕鏈霉素濃縮液（重慶西南藥業(yè)股份有限公司），胎牛血清（FBS，美國Sigma公司），EdU keyFluor488熒光檢測試劑盒（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），其他常規(guī)試劑山羊封閉血清、4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）染液、杜氏磷酸緩沖液（DPBS）、Triton X?100原液等（杭州四季青生物工程材料有限公司）。倒置熒光可視化顯微鏡（德國Zeiss公司）。

二、方法

1.胎鼠皮膚微創(chuàng)后培養(yǎng)：7周齡SPF級健康昆明（KM）遠(yuǎn)交系小鼠（SCXK 2012?0007）由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雌雄各10只，體重40～60 g（批號0014379）。塔里木大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心定期對小鼠進(jìn)行致病原檢測以確保孕鼠符合本試驗(yàn)要求，試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在通風(fēng)潔凈區(qū)，均采用SPF級潔凈鼠糧飼養(yǎng)。小鼠采用斷頸法處死，并嚴(yán)格遵守中國實(shí)驗(yàn)動物倫理保護(hù)法。實(shí)驗(yàn)中同一天受孕的母鼠6只，取孕齡為15 d的6只KM母鼠并處死，浸泡于75%乙醇10 min，超凈工作臺內(nèi)將子宮取出，共取出63只胎鼠。隨機(jī)取60只胎鼠（另3只胎鼠取其皮膚直接包埋制冰凍切片，觀察胎鼠皮膚正常結(jié)構(gòu)），用眼科微型手術(shù)器械小心剝離胎鼠背部皮膚，每只胎鼠于解剖顯微鏡下分成等面積的3塊皮片，共獲得180塊皮片。用無菌微創(chuàng)器在皮片上統(tǒng)一造創(chuàng)，微創(chuàng)口直徑統(tǒng)一為2 mm。用顯微外科鑷把人工微創(chuàng)胎鼠皮片隨機(jī)轉(zhuǎn)移到6組培養(yǎng)液中，分別為DMEM組、DMEM+5%FBS組、DMEM+10%FBS組、MEM組、MEM+5%FBS組、MEM+10%FBS組，此外各組培養(yǎng)液中再加入10%青∕鏈霉素稀釋液100 μl。每組有3個(gè)相同培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)10塊皮片，其中隨機(jī)選取1個(gè)培養(yǎng)皿加入20 μmol∕L EdU干細(xì)胞標(biāo)記物100 μl，最終每個(gè)培養(yǎng)皿中2 ml，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。皮片OCT包埋后制作冰凍切片，厚度6 μm，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.胎鼠皮膚切片的HE染色：從-20℃冰箱中取出胎鼠皮膚冰凍切片，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察。

3.胎鼠皮膚干細(xì)胞增殖標(biāo)記染色：皮片培養(yǎng)3 d后，顯微鏡下觀察皮膚愈合情況，選出愈合最好的標(biāo)記組，其中每張EdU標(biāo)記培養(yǎng)的胎鼠皮膚組織切片滴加1 ml 4%甲醛室溫固定30 min，3%牛血清蛋白（BSA）漂洗2次，每次5 min，加入1 ml 0.5% Triton X?100透膜20 min后，再使用3%BSA漂洗2次，每次5 min，去除滲透劑。每張玻片上加入0.5 ml Key Fluor488 Click?iT反應(yīng)混合物（根據(jù)說明書現(xiàn)用現(xiàn)配），室溫避光孵育30 min。棄去Click?iT反應(yīng)混合物，使用3%BSA漂洗2次，每次5 min，去除反應(yīng)混合物，滴加抗熒光猝滅劑，蓋玻片封片，倒置熒光顯微鏡暗房拍照。其中增殖細(xì)胞的細(xì)胞核可被EdU標(biāo)記，形成綠色熒光，而未增殖細(xì)胞的細(xì)胞核，可被Hoechst標(biāo)記，發(fā)出紅色熒光。

4.胎鼠皮膚切片的免疫熒光檢測：冰凍切片4%甲醛固定30 min，PBS（pH 7.2～7.4）清洗3次，1%Triton X?100透膜20 min，3%BSA和10%山羊血清各250 μl混合滴入冰凍切片，放入濕盒4℃避光孵育1 h。倒去孵育液，滴加兔抗小鼠AP?1一抗（1∶150稀釋）100 μl，以PBS代替一抗做陰性對照，4℃濕盒孵育過夜，PBS清洗3次，滴加山羊抗兔FITC熒光二抗（1∶200稀釋）200 μl及DAPI，4℃濕盒避光孵育1 h，PBS沖洗3次，抗熒光猝滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下拍照并分析數(shù)據(jù)。

5.統(tǒng)計(jì)分析方法：利用圖像分析軟件Motic統(tǒng)計(jì)胎鼠微創(chuàng)皮片愈合數(shù)目，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，χ2檢驗(yàn)分析各組愈合率差異，logistic回歸模型分析胎鼠微創(chuàng)皮片愈合的影響因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、正常胎鼠皮膚結(jié)構(gòu)觀察

KM胎鼠皮膚組織切片HE染色顯示（圖1），胎鼠皮膚由表皮和真皮構(gòu)成，其中真皮緊貼表皮的基底層，并由乳頭層和網(wǎng)狀層兩部分構(gòu)成，真皮層中含有大量成纖維細(xì)胞和少量淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞（圖1A）。在無激發(fā)光通道條件下，細(xì)胞核DAPI熒光染色顯示，胎鼠表皮由顆粒層、棘層和基底層構(gòu)成（圖1B）。

圖1 新鮮分離的胎鼠皮膚結(jié)構(gòu) 1A：胎鼠真皮結(jié)構(gòu)，包括乳頭層和網(wǎng)狀層，含有大量成纖維細(xì)胞和少量淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞（HE×100）；1B：細(xì)胞核DAPI熒光染色顯示，胎鼠表皮由顆粒層、棘層和基底層構(gòu)成（×400）

二、胎鼠皮片人工微創(chuàng)口愈合形態(tài)學(xué)觀察

胎鼠微創(chuàng)皮片培養(yǎng)3 d時(shí)，對比相同F(xiàn)BS濃度下不同基礎(chǔ)培養(yǎng)液組胎鼠背部皮片創(chuàng)口愈合情況發(fā)現(xiàn)，DMEM組的胎鼠皮膚創(chuàng)口總體愈合不好（圖2A～2C），創(chuàng)口幾乎無愈合跡象。添加FBS后，真皮網(wǎng)狀層有不同程度延長，但表皮一直未愈合。MEM組胎鼠皮膚創(chuàng)口同樣沒有愈合跡象（圖2D），添加FBS后，胎鼠皮膚表皮層發(fā)生交互融合。5%FBS+MEM組創(chuàng)面愈合處真皮和表皮貼合緊密，真皮部位無缺損（圖2E e區(qū)），10%FBS+ MEM組創(chuàng)面愈合處表皮愈合無增厚現(xiàn)象，真皮層延伸并緊密相連，但愈合薄弱，與表皮之間的空隙較大（圖2F f區(qū)）。

三、胎鼠微創(chuàng)皮片愈合最佳培養(yǎng)條件的篩選

以表皮和真皮同時(shí)愈合記為愈合，計(jì)算各組皮片愈合率。DMEM組、DMEM+5%FBS組、DMEM+ 10%FBS組、MEM組、MEM+5%FBS組、MEM+ 10%FBS組皮片愈合率分別為0、3.33%、6.67%、3.33%、46.67%、26.67%，6組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=41.39，P＜0.05）。調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01并進(jìn)行兩兩比較顯示，MEM+5%FBS組皮片愈合率顯著高于除MEM+10%FBS組外的其他4組（均P＜0.01），且MEM+10%FBS組皮片愈合率亦顯著高于DMEM組（均P＜0.01）。采用logistic回歸模型分析基礎(chǔ)培養(yǎng)基的類型（DMEM或MEM）及FBS濃度對胎鼠微創(chuàng)皮片愈合的影響，結(jié)果顯示，MEM（以DMEM為對照，OR=11.717，95%CI 3.274～41.934，P＜0.001）及FBS濃度（以不添加FBS為對照，5% FBS：OR=24.625，95%CI 3.027～200.299，P= 0.003；10%FBS：OR=13.449，95%CI 1.618～111.813，P=0.016），均是促進(jìn)胎鼠微創(chuàng)皮片愈合的因素。

圖2 微創(chuàng)胎鼠皮膚在6種不同條件下培養(yǎng)3 d愈合形態(tài)學(xué)觀察（HE×100） DMEM：高糖改良Eagle培養(yǎng)基，MEM：低糖Eagle培養(yǎng)基；De：真皮，Ep：表皮；e、f框內(nèi)分別是圖2E、2F創(chuàng)面愈合處；2A、2D：分別為DMEM組和MEM組，胎鼠皮膚人工微創(chuàng)口幾乎無愈合跡象；2B、2C：分別為DMEM+5%胎牛血清（FBS）組和DMEM+10%FBS組，真皮網(wǎng)狀層有不同程度的延長，但表皮一直未愈合；2E：MEM+5%FBS組，胎鼠皮膚創(chuàng)面愈合處（e區(qū)）真皮和表皮貼合緊密，真皮部位無缺損；2F：MEM+10%FBS組，胎鼠創(chuàng)面愈合處（f區(qū)）表皮愈合無增厚現(xiàn)象，真皮層延伸并緊密相連，但真皮部位愈合薄弱，且與表皮之間的空隙較大

四、胎鼠皮膚干細(xì)胞再生標(biāo)記

選擇MEM+5%FBS組行皮膚干細(xì)胞增殖標(biāo)記染色。倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)增殖細(xì)胞主要位于表皮基底層；創(chuàng)面左右兩側(cè)的真皮乳頭層干細(xì)胞也大量增殖（圖3A，白色箭頭所指處綠色熒光區(qū)域），真皮乳頭層中細(xì)胞大量增殖（圖3B）；皮片無創(chuàng)傷處乳頭層細(xì)胞增殖活性強(qiáng)于基底層（圖3C）。

圖3 MEM+5%FBS組胎鼠皮膚創(chuàng)面愈合過程中EdU標(biāo)記皮膚干細(xì)胞分裂增殖情況 De：真皮，Ep：表皮；白色虛線是胎鼠真皮和表皮的分界線，白色箭頭為皮膚干細(xì)胞增殖活躍區(qū)。3A：胎鼠皮膚創(chuàng)面愈合處，干細(xì)胞增殖主要位于表皮基底層和真皮乳頭層；3B：胎鼠皮膚外緣游離端，干細(xì)胞增殖亦主要位于真皮乳頭層；3C：皮片無創(chuàng)傷處，乳頭層細(xì)胞增殖活性強(qiáng)于基底層；3D：正常未人工造創(chuàng)皮片行Hoechst染色作為對照組，紅色熒光為未增殖細(xì)胞的細(xì)胞核

五、AP?1在胎鼠皮膚無瘢痕愈合中的表達(dá)

MEM+5%FBS組胎鼠人工微創(chuàng)皮片中AP?1抗體免疫熒光染色結(jié)果見圖4A～4C。胎鼠皮膚創(chuàng)口愈合處真皮細(xì)胞核（圖4D）和表皮細(xì)胞核（圖4E）中均見AP?1蛋白大量表達(dá)，同時(shí)創(chuàng)面愈合處表皮增厚，細(xì)胞增多，基底層細(xì)胞出現(xiàn)不對稱分裂，并向真皮部突起，新分裂的細(xì)胞核形態(tài)和基底層細(xì)胞核形態(tài)不同，但同樣都表達(dá)AP?1蛋白。陰性對照真皮層細(xì)胞中未出現(xiàn)AP?1蛋白的綠色熒光，只有細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色熒光（圖4F）。

討論

皮膚的瘢痕愈合一直是臨床創(chuàng)面治療中的主要問題，在目前物理和藥物治療手段下，皮膚創(chuàng)面愈合后的瘢痕可以縮小，但不能完全消除。研究顯示［4?5］，皮膚創(chuàng)面瘢痕的形成與巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系，而胚胎時(shí)期機(jī)體免疫系統(tǒng)不完整，免疫力相對薄弱，受到創(chuàng)傷后不會發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，不會形成肉芽組織，因此不會導(dǎo)致瘢痕增生。研究者檢測不同胚胎時(shí)期和成體小鼠皮膚基因表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，胚胎晚期及胎鼠出生后一些促進(jìn)創(chuàng)面愈合的基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合達(dá)不到無瘢痕，而在胚胎時(shí)期一些具有調(diào)控干細(xì)胞增殖和分化的基因表達(dá)是上調(diào)的［6?7］，因此調(diào)控干細(xì)胞增殖分化的基因表達(dá)差異可能是創(chuàng)面瘢痕形成的一個(gè)重要因素。

圖4 MEM+5%FBS組胎鼠人工微創(chuàng)皮膚愈合過程中AP?1蛋白表達(dá)的鑒定 4A：胎鼠皮膚創(chuàng)口愈合處AP?1蛋白呈綠色熒光；4B：胎鼠皮膚創(chuàng)口愈合處細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色呈藍(lán)色熒光；4C：AP?1蛋白綠色熒光與細(xì)胞核藍(lán)色熒光疊加；4D、4E：分別為圖4C中標(biāo)記區(qū)域的局部放大，白色箭頭所指處分別顯示真皮和表皮部位均有AP?1蛋白的大量表達(dá)；4F：陰性對照

我們用顯微外科解剖技術(shù)獲取無菌且不含皮下組織的胎鼠皮膚，未經(jīng)胰酶和膠原酶的消化處理，可較好地保留胎鼠皮片活性及修復(fù)功能。培養(yǎng)過程中游離的胎鼠皮片可以自我釋放一些細(xì)胞生長因子，參與傷口修復(fù)［8?9］，同時(shí)皮膚內(nèi)部少量淋巴細(xì)胞也參與輕微炎癥反應(yīng)，它們之間進(jìn)行一系列復(fù)雜的相互作用共同參與創(chuàng)面修復(fù)。我們觀察正常胎鼠皮膚結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)表皮僅由顆粒層、棘層和基底層構(gòu)成?？赡苁且?yàn)樘ナ笃つw處于羊水環(huán)境中，角質(zhì)層細(xì)胞脫落于羊水中而未被觀察到，而透明層主要出現(xiàn)在四肢掌部，一般不出現(xiàn)在背部皮膚。

本研究分別采用MEM（低糖）與DMEM（高糖）2種培養(yǎng)液作為胎鼠皮膚創(chuàng)口愈合的外環(huán)境，以優(yōu)化選擇最適用于皮膚創(chuàng)口愈合的培養(yǎng)液。結(jié)果顯示，DMEM組胎鼠皮片創(chuàng)口總體愈合不如MEM組，可能是高糖因素導(dǎo)致皮膚細(xì)胞代謝紊亂，降低細(xì)胞運(yùn)輸氧的能力，使創(chuàng)口不易愈合且易被細(xì)菌污染。此外，F(xiàn)BS中各種充足的營養(yǎng)成分及生長因子也可促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。本研究采用logistic回歸模型分析顯示，MEM及FBS濃度均是促進(jìn)胎鼠微創(chuàng)皮片愈合的因素，同時(shí)結(jié)合倒置顯微鏡觀察各組皮片愈合形態(tài)，認(rèn)為MEM+5%FBS為胎鼠微創(chuàng)皮片愈合的最佳培養(yǎng)條件。

本研究中EdU標(biāo)記熒光強(qiáng)信號區(qū)為胎鼠皮膚創(chuàng)面愈合處的真皮乳頭層和表皮基底層，是表皮干細(xì)胞的存在區(qū)域，同時(shí)說明胎鼠皮膚的真皮乳頭層也含有皮膚源干細(xì)胞，在皮膚創(chuàng)面愈合過程中可以進(jìn)行創(chuàng)面的填充。AP?1蛋白作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)和胚胎發(fā)育等病理生理過程中起重要作用［10?11］。我們檢測MEM+5%FBS組胎鼠皮片時(shí)發(fā)現(xiàn)，皮膚創(chuàng)面愈合中兩個(gè)主要增殖活躍區(qū)，即真皮乳頭層和表皮基底層均有AP?1蛋白的大量表達(dá)，說明這兩個(gè)區(qū)域在胚胎皮膚損傷愈合過程中發(fā)揮重要作用。陰性對照組真皮層細(xì)胞中未出現(xiàn)AP?1蛋白的綠色熒光，可排除實(shí)驗(yàn)中的非特異性染色。其中表皮顆粒層出現(xiàn)綠色熒光，可能是因?yàn)楸砥ゎw粒層由富含組氨酸的強(qiáng)嗜堿性蛋白顆粒組成，易與二抗熒光色素結(jié)合而引起非特異性著色。

綜上所述，胎齡15 d的KM胎鼠皮膚創(chuàng)面最佳愈合培養(yǎng)液條件為MEM+5%FBS，而胎鼠皮膚的真皮乳頭層和表皮基底層是創(chuàng)面愈合過程中兩個(gè)主要的細(xì)胞增殖活躍區(qū)，其中的細(xì)胞可大量表達(dá)AP?1蛋白。本研究為建立體外胚胎皮膚創(chuàng)傷無瘢痕愈合模型奠定基礎(chǔ)，為胚胎皮膚細(xì)胞增殖活躍區(qū)的定位及胚胎創(chuàng)傷無瘢痕愈合機(jī)制研究提供新的思路。

志謝塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)平臺，李樹偉教授對本研究提供的支持

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中國麻風(fēng)史料陳列館、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所史料陳列館征集文物和史料啟事

為真實(shí)記載中國麻風(fēng)防治的發(fā)展歷程，全方位展現(xiàn)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院、研究所（簡稱院所）60余載的歷史變革和文化積淀，傳承和發(fā)揚(yáng)老一輩無私奉獻(xiàn)的精神，院所決定籌建中國麻風(fēng)史料陳列館、院所史料陳列館。即日起，面向社會各界廣泛征集具有歷史價(jià)值的文物和史料。

一、征集范圍

1.反映院所各歷史時(shí)期發(fā)展沿革、重大活動、科研成就、領(lǐng)導(dǎo)關(guān)懷及院所職工參加國內(nèi)外重大活動等方面的重要文獻(xiàn)、題詞、圖片、新聞報(bào)道、手稿、徽標(biāo)、紀(jì)念冊、音像制品、獎(jiǎng)狀、證書等。

2.國家領(lǐng)導(dǎo)人、社會知名賢達(dá)及重要外賓、杰出校友來院所參觀、考察、訪問或演講時(shí)的題詞、圖片、新聞報(bào)道、音像制品等。

3.各類皮膚性病、麻風(fēng)防治的圖片、圖表及文字說明，醫(yī)、教、研、防、管等領(lǐng)域工作中使用過的辦公用品、儀器設(shè)備、書籍教案、教學(xué)工具等實(shí)物。

4.反映中國麻風(fēng)防治歷程及成就，麻風(fēng)受累者的醫(yī)療及生活狀況等有歷史價(jià)值的文物和史料。

二、征集方式及要求

1.文物和史料的征集采用捐贈、代管、借用等方式。

2.所有文物和史料請?zhí)峁┪淖终f明，含來源、史料載體、形成時(shí)間及其所涉及的人物、事件等要素。

3.文物和史料的征集歡迎直接送達(dá)；亦可通過電子傳送、信函郵寄、預(yù)約拜訪、登門征集等途徑進(jìn)行。

4.征集的文物和史料，均登記入冊；一經(jīng)采用，除在史館陳列時(shí)標(biāo)注捐贈者的姓名外，將授贈榮譽(yù)證書。

5.征集時(shí)間：長期征集。

三、聯(lián)系方式

聯(lián)系人：210042，南京玄武區(qū)蔣王廟街12號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所中心辦公室（科研樓415室）諸萍，電話：025-85478032，傳真：025?85424903，Email：zhup@ncstdlc.org。

Optimization of culture medium for scarless healing of fetal mouse wounds and analysis of regions with active cell proliferation

Wang Haitao,Jiang Renjun,Li Shuwei
Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin,College of Life Sciences,Tarim University,Alaer 843300,Xinjiang,China

Li Shuwei,Email:xj_lsw@126.com

Objective To optimize the culture medium for scarless wound healing in outbred fetal Kunming（KM）mice,and to locate and preliminarily analyze the region with active cell proliferation. Methods After 6 pregnant mice were sacrificed at the gestational age of 15 days,a total of 180 skin grafts were obtained from the back of 60 fetal mice,and wounds on the skin grafts were made uniformly with minimally invasive sterile device.Then,these skin grafts with wounds were randomly and equally divided into 6 groups to be treated with high?glucose Dulbecco′s modified Eagle′s medium（DMEM）,DMEM+5% fetal bovine serum（FBS）,DMEM+10%FBS,low?glucose Eagle′s minimum essential medium（MEM）, MEM+5%FBS,and MEM+10%FBS for 3 days,respectively.Then,these skin grafts were embedded in optimal cutting temperature（OCT）compound,and subjected to hematoxylin and eosin（HE）staining to select the optimal culture condition for wound healing.Under the optimal culture condition,the region with active cell proliferation was located by labeling and tracking cutaneous stem cells with 5?ethynyl?2?deoxyuridine（EdU）,and activator protein?1（AP?1）expression was detected by immunofluorescent staining.Results After 3?day cultivation,wound healing rates significantly differed among the DMEM group,DMEM+5%FBS group,DMEM+10%FBS group,MEM group,MEM+5%FBS group and MEM+ 10%FBS group（0,3.33%,6.67%,3.33%,46.67%and 26.67%,respectively,χ2=41.39,P＜0.05）. Additionally,the MEM+5%FBS group showed a significantly higher wound healing rate than the other groups except the MEM+10%FBS group（all P＜0.01）.Logistic regression analysis showed that the type of basal medium（MEM:OR=11.717,95%CI:3.274-41.934,P＜0.001）and FBS concentrations（5% FBS:OR=24.625,95%CI:3.027-200.299,P=0.003;10%FBS:OR=13.449,95%CI:1.618-111.813,P=0.016）were factors influencing fetal wound healing.Under the culture condition of 5%FBS+ MEM,the dermis and epidermis healed well without epidermal thickening.The cutaneous stem cell labeling technique showed that the papillary dermis and basal layer of the epidermis were the two major regions with active cell proliferation in the wound of fetal mouse skin.Moreover,AP?1 was expressed abundantly in these two regions as well.Conclusions The culture condition of 5%FBS+MEM is considered to be optimal for in vitro wound healing in fetal mice.The papillary dermis and basal layer of the epidermis are two major regions with active cell proliferation during wound healing in fetal mouse skin,and play important roles in wound healing process.

Wound healing;Cicatrix;Transcription factor AP?1;Scarless wound healing;Fetal mice

李樹偉，Email：xj_lsw@126.com

10.3760∕cma.j.issn.0412?4030.2017.02.007

國家自然科學(xué)基金（31560685）；塔里木大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（TDGRI201521）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31560685）;Master Creation Project of Tarim University（TDGRI201521）

2016?05?13）

（本文編輯：周良佳 顏艷）