周英姿 趙學軍 徐錦屏 王小婕

FOXC2對卵巢癌血管生成及作用機制的研究

周英姿 趙學軍 徐錦屏 王小婕

目的探討叉頭框C2(forkhead box C2，F(xiàn)OXC2)對人卵巢癌腫瘤血管生成及作用機制。方法應(yīng)用FOXC2慢病毒基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將FOXC2-LV和空載體基因分別轉(zhuǎn)染到人卵巢癌A2780細胞株。細胞分為未轉(zhuǎn)染組、空載體組和FOXC2過表達組。Matrigel基質(zhì)膠血管形成實驗和Transwell小室檢測各組細胞上清作用下人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUEVCs)成管能力和遷移能力的變化。RT-PCR檢測各組細胞FOXC2、DLL4/Notch1、內(nèi)皮細胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP2) mRNA表達，Western blot檢測各組細胞FOXC2、DLL4/Notch1、CD31和MMP2蛋白表達。結(jié)果FOXC2過表達組A2780細胞上清誘導HUEVCs閉合小管數(shù)和遷移細胞數(shù)均顯著高于未轉(zhuǎn)染組、空載體組(P<0.05)。FOXC2過表達組DLL4/Notch1、CD31和MMP2 mRNA表達水平均顯著高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組(P<0.05)。FOXC2過表達組DLL4/Notch1、CD31和MMP2 mRNA蛋白表達水平均顯著高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組(P<0.05)。結(jié)論FOXC2可能通過上調(diào) DLL4/Notch1、CD38及MMP2表達促進HUEVCs成管能力和遷移能力，影響卵巢癌發(fā)展。

FOXC2；卵巢癌；腫瘤；血管生成；作用機制

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1591～1595)

隨著腫瘤基因?qū)W研究的發(fā)展，諸多報道稱[1-3]，部分基因及蛋白可調(diào)控促血管和抑血管生成因子表達，直接影響卵巢癌等惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。FOXC2叉頭框C2(Forkhead box C2，F(xiàn)OXC2)作為1種翼狀螺旋/FOX蛋白，進化上有高度保守性，編碼蛋白結(jié)構(gòu)包含494個氨基酸殘基，可調(diào)控血管生成、機體組織器官代謝、正常細胞或腫瘤細胞增殖及凋亡、干細胞分化發(fā)育和腫瘤細胞遷移浸潤等[4-6]，但關(guān)于該基因?qū)τ诼殉舶┭苌捎绊懠白饔脵C制尚未有清晰結(jié)論。本文通過慢病毒轉(zhuǎn)染獲取高表達FOXC2人卵巢癌A2780細胞，旨在觀察FOXC2對內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)遷移和血管形成能力影響和探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑及儀器

人卵巢癌A2780細胞株購自中國科學院上海細胞庫，人臍靜脈內(nèi)皮細胞購自上海賽齊生物工程有限公司，F(xiàn)OXC2慢病毒購自上海吉凱基因有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試(RT-PCR)劑盒購自日本TaKaRa公司，山羊抗人FOXC2和DLL4均購自美國Sigma公司，兔抗人Notch1、兔抗人CD31和兔抗人MMP2多克隆抗體均購自美國Abcam公司，HRP標記兔抗羊IgG二抗購自北京索萊寶科技有限公司，HRP標記羊抗兔IgG二抗購自南京生興生物技術(shù)有限公司，ChampGel全自動凝膠成像分析儀購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，9703型梯度PCR儀購自中國賽飛有限公司，DU640RNA/蛋白定量儀購自美國貝克曼庫爾特公司，霍夫曼相襯倒置顯微鏡DYS-810購自德國(中國)霍夫曼公司，奧林巴斯CX23熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

A2780細胞和HUVECs分別置于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2 d換液1次。A2780細胞傳2代，4 d/代，1∶2傳代，HUVECs傳2代，4 d/代，1∶3傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學，待細胞融合至80%時，細胞培養(yǎng)密度≥90%，臺盼藍測定活細胞率≥95%時。分別取5 μl細胞液分為未轉(zhuǎn)染組、空載體組和FOXC2過表達組。

1.3 FOXC2慢病毒轉(zhuǎn)染A2780細胞

根據(jù)上海吉凱基因有限公司提供的Lentiviral Vector Particle使用手冊將FOXC2慢病毒質(zhì)粒(FOXC2-LV)轉(zhuǎn)入A2780細胞，設(shè)為FOXC2過表達組，同時將空載體質(zhì)粒(GFP-LV)轉(zhuǎn)入A2780細胞，設(shè)為空載體組，而將未轉(zhuǎn)染細胞設(shè)為未轉(zhuǎn)染組。取各組生長狀態(tài)良好的A2780細胞，胰酶消化并計數(shù)，調(diào)整細胞密度4×104個/孔，接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組均設(shè)3個復孔。培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)，待細胞融合至40%左右時，按照感染復數(shù)(MOI)=20分別滴入30%體積指數(shù)FOXC2-LV和GFP-LV液，滴入Polybrene病毒感染增強劑培養(yǎng)12 h后，再更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，置于熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白表達；根據(jù)H.Liu等研究結(jié)果[8]，于轉(zhuǎn)染72h后觀察，待細胞消化后置于培養(yǎng)瓶內(nèi)擴大培養(yǎng)。上鏡觀察、計算細胞轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染率=(綠色細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

1.4基質(zhì)膠血管形成實驗

取各組細胞液3 ml，調(diào)整細胞密度5×105ml/孔后接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后收集上清液；將 Matrigel基質(zhì)膠和RPMI-1649培養(yǎng)基按照1∶9比例混合，輕晃均勻后按照40 μL/孔加入96孔板內(nèi)，置于37 ℃培養(yǎng)過夜備用。取HUVECs調(diào)整至3×103個/孔接種于96孔板中，每組均設(shè)置5個復孔，培養(yǎng)3 d后，置于倒置顯微鏡下觀察、照相，任取10個視野拍照，計數(shù)成管數(shù)。

1.5 體外遷移實驗

消化后HUVECs內(nèi)滴入RPMI-1649培養(yǎng)基重懸至5×105/mL，Transwell小室上室滴入0.4 ml細胞重懸液，下室滴入0.6 mL相應(yīng)腫瘤上清，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)12 h后，置于倒置顯微鏡下，觀察遷移上室至下室細胞數(shù)量、形態(tài)，取出小室后吸去上室液體后，棉簽擦去上室細胞，滴入4%多聚甲醛固定約20 min及蘇木精染色3 h后置于載玻片上，中性樹膠封片，×400倍光鏡觀察，隨機選取10個視野計數(shù)，計算平均值，重復實驗3次。

1.6 PCR法測定FOXC2、DLL4/Notch1、CD31和MMP2 mRNA表達

Trizol法提取3組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作方法按照逆轉(zhuǎn)錄實驗盒說明書執(zhí)行。FOXC2、DLL4/Notch1、CD31和MMP2引物設(shè)計及擴增條件如表1所示，反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM II(2×)10 μl，PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μl，Uni-miR qPCR Primer(10 μM)0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，cDNA模板溶液2 μl，dH 206 μl，添加蒸餾水至20 μl。擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)32次，72 ℃最終延伸7 min。引物電泳后使用Bio-rad成像系統(tǒng)拍照采集圖像，使用ImageJ分析軟件測定條帶灰度值即A值，以GAPDH為參考值，計算各基因mRNA相對表達，重復實驗3次取平均值。

1.7 Western blot測定FOXC2、DLL4/Notch1、CD31和MMP2蛋白表達

使用細胞裂解液(RIPA)提取細胞蛋白，操作按照試劑盒附帶說明書執(zhí)行，BCA法測定蛋白濃度，操作按照試劑盒附帶說明書執(zhí)行，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)采集蛋白電泳圖像，Quantity one圖像分析軟件定量分析FOXC2、DLL4/Notch1、CD31和MMP2蛋白表達即A值，以β-action為內(nèi)參，計算各基因及信號通路蛋白相對表達，重復實驗3次取平均值。

表1 引物序列設(shè)計及擴增條件

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 A2780細胞FOXC2轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染72 h后，F(xiàn)OXC2質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780細胞均顯示綠色熒光，空載體組轉(zhuǎn)染率為88.94%，F(xiàn)OXC2過表達組轉(zhuǎn)染率為82.23%，兩組差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.25，P=0.119>0.05)。

2.2 各組A2780細胞上清液促進HUVECs成管能力測定結(jié)果

培養(yǎng)72 h后，F(xiàn)OXC2過表達組小管樣結(jié)構(gòu)為(11.82±1.86)個，空載體組為(4.42±1.19)個，未轉(zhuǎn)染組為(4.64±1.16)個，F(xiàn)OXC2過表達組小管樣結(jié)構(gòu)數(shù)高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組，差異具有統(tǒng)計學意義(F=7.923，P=0.0024<0.01)。

2.3 各組A2780細胞上清液對HUVECs遷移能力的影響

培養(yǎng)72 h后，F(xiàn)OXC2過表達組遷移細胞數(shù)為(167.62±6.85)個，未轉(zhuǎn)染組為(104.02±5.68)個，空載體組為(105.35±7.52)個，F(xiàn)OXC2過表達組遷移細胞數(shù)高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組，差異具有統(tǒng)計學意義(F=6.204，P=0.0062<0.01)。

2.4 各組A2780細胞FOXC2、DLL4、Notch1、CD31和MMP2 mRNA相對表達比較

FOXC2過表達組FOXC2、DLL4、Notch1、CD31和MMP2 mRNA相對表達水平均高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2和圖1。

2.5 各組A2780細胞FOXC2、DLL4、Notch1、CD31和MMP2蛋白相對表達比較

FOXC2過表達組FOXC2、DLL4、Notch1、CD31和MMP2蛋白相對表達水平，均高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3和圖2。

3 討論

Lin等研究證實[7]，F(xiàn)OXC2作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)誘導因子之一，能夠上調(diào)上皮標志物E-cadherin表達，并引導乳腺腫瘤上皮細胞去分化及轉(zhuǎn)移。Imayama等[8]通過分析FOXC2加減(+/-)劑量和腫瘤血管生成間的關(guān)系得出，F(xiàn)OXC2+劑量可促使腫瘤血管快速生產(chǎn)及發(fā)育，而FOXC2-劑量則可致血管生成障礙及生長速度下調(diào)。權(quán)原等報道稱[9]，上調(diào)EPCs內(nèi)FOXC2表達，可促使正常血管損傷修復?；诖耍虼?，我們選擇FOXC2做為研究影響卵巢癌腫瘤血管生成機制的靶向因子。

表2 各組FOXC2、DLL4、Notch1、CD31和MMP2 mRNA相對表達水平比較

注：與未轉(zhuǎn)染組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；與空載組比較，#為P<0.05，##為P<0.01。

A為未轉(zhuǎn)染組；b為空載體組；c為FOXC2過表達組。

組別FOXC2DLL4Notch1CD31MMP2未轉(zhuǎn)染組0.373±0.0090.252±0.0110.277±0.0240.318±0.0320.294±0.036空載體組0.363±0.0110.245±0.0240.245±0.0210.324±0.0380.302±0.042FOXC2過表達組0.743±0.044**##0.435±0.049**##0.437±0.042*#0.512±0.049*#0.658±0.062**##F6.3795.6244.8664.1978.962P0.00580.00860.0110.019<0.001

注：與未轉(zhuǎn)染組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；與空載組比較，#為P<0.05，##為P<0.01。

a為未轉(zhuǎn)染組；b為空載體組；c為FOXC2過表達組。

在本研究中，我們選擇FOXC2慢病毒質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染經(jīng)體外分離培養(yǎng)的A2780細胞，轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，空載體組轉(zhuǎn)染率和FOXC2過表達組轉(zhuǎn)染率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，證明研究選用轉(zhuǎn)染后的A2780細胞符合實驗要求。相關(guān)文獻顯示[10]，F(xiàn)OXC2激活、誘導趨化因子受體4(CXCR4) 和整合素-β3啟動子轉(zhuǎn)錄，引導腫瘤血管生成，并可作為重要的誘導因子啟動上皮細胞與間充質(zhì)間的轉(zhuǎn)化過程，從而開啟和促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。在本研究中，筆者選擇不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染A2780細胞上清液干擾HUVECs成管能力，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2過表達組小管樣結(jié)構(gòu)數(shù)顯著高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組(P<0.01)，這表明FOXC2可促進HUVECs生成新血管和淋巴管，刺激卵巢癌腫瘤生長。Herrera等通過研究乳腺癌細胞株可得[11]，F(xiàn)OXC2表達增強可提高腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在本研究中，F(xiàn)OXC2過表達組遷移細胞數(shù)顯著高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組(P<0.01)，結(jié)果符合其結(jié)論，這表明FOXC2異常表達可能和卵癌細胞向遠處侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

DLL4和Notch1在具有高度進化保守特征的Notch信號通路重互為配體和受體，DLL4通過結(jié)合Notch1，啟動前者轉(zhuǎn)錄和翻譯而上調(diào)其表達，并和更多的Notch1結(jié)合，決定胎血管向動脈血管或靜脈血管分化。Kashatus等[12]研究表明DLL4及其下游靶點Hey基因變異，可致內(nèi)皮細胞內(nèi)ephrin-B2表達下降，從而誘發(fā)小鼠卵巢癌腫瘤血管重構(gòu)嚴重缺陷。在本研究中，F(xiàn)OXC2過表達組FOXC2、DLL4、Notch1 mRNA及蛋白相對表達均高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組(P<0.05)，這表明FOXC2和DLL4、Notch1 mRNA及蛋白同時高表達時，卵巢癌腫瘤細胞影響下的HUVECs成管能力及向遠處轉(zhuǎn)移能力顯著得到增強，我們認為FOXC2可能通過Notch信號通路影響卵巢癌等腫瘤血管生成、生長。

Wang等[13]用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制FOX家族成員FOXM1表達，可顯著下調(diào)血管內(nèi)皮標志物MMP2及內(nèi)皮細胞組織標志物CD31等表達，證明FOXM1可能是治療胰腺癌的新靶點。我們認為作為同屬FOX家族成員的FOXC2也可能具有相同屬性，本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2過表達組FOXC2、CD31和MMP2 mRNA和蛋白相對表達均高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組(P<0.05)，表明上調(diào)FOXC2表達也可提高CD31和MMP2表達，從而刺激卵巢癌腫瘤細胞新血管生成能力，促使腫瘤生長，基于該實驗結(jié)果提示FOXC2也可能是卵巢癌治療新基因靶點。

綜上所述，高表達FOXC2可促使卵巢癌腫瘤血管生成及腫瘤遷移，其作用機制可能通過上調(diào)DLL4/Notch1信號通路及CD31和MMP2表達實現(xiàn)。

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EffectofFOXC2onAngiogenesisandProliferationofOvarianCancerandItsMechanism

ZHOUYingzi，ZHAOXuejun，XUJinbing，etal.

ShanghaiChangningDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Shanghai,200051

ObjectiveTo investigate the effect of box C2 C2(FOXC2) on the angiogenesis and the mechanism of tumor angiogenesis in human ovarian cancer.MethodsFOXC2-LV and empty vector were transfected into human ovarian cancer cell line A2780 by gene transfer technique.The cells were divided into non transfection group,empty vector group and FOXC2 over expression group.Matrigel Matrigel angiogenesis assay and Transwell assay of human umbilical vein endothelial cells cell supernatant effect(HUEVCs) changes of tube capability and migration capability.The expression levels of mRNA of FOXC2,DLL4/Notch1,detectendothelial cell adhesion molecules(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31) and matrix metalloproteinase 2(matrix,metalloproteinase-2,MMP2) in cells of each group were detected by RT-PCR,Western expression of blot cells were detected with the expression levels of protein of FOXC2,DLL4/Notch1,CD31 and MMP2 in cells of each group were detected by western blot.ResultsThe number and number of HUEVCs cells in A2780 cells of FOXC2 over expression group were significantly higher than those of non transfection group and empty vector group(P<0.05).The expression levels of mRNA of FOXC2,DLL4/Notch1,CD31 and MMP2 in FOXC2 over expression group were significantly higher than those of non transfection group and empty vector group(P<0.05).The protein expressions levels of FOXC2,DLL4/Notch1,CD31 and MMP2 in FOXC2 over expression group were significantly higher than those of non transfection group and empty vector group(P<0.05).ConclusionFOXC2 may promote expression levels of DLL4/Notch1,CD38 and HUEVCs by up regulating the MMP2 tube forming ability and migration ability,and affect the development of ovarian cancer.

FOXC2;Ovarian cancer;Tumor;Angiogenesis;Mechanism of action

200051 上海市長寧區(qū)婦幼保健院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.10.008

R737.31

A

1001-5930(2017)10-1591-05

2016-09-08

2017-04-25)

(編輯吳小紅)