王偉，張大燕，文歡，汪頎浩，彭成，高繼海

【研究論著】

川貝母組織培養(yǎng)的影響因素研究

王偉，張大燕，文歡，汪頎浩，彭成，高繼海

目的：以川貝母鱗莖外表基部為材料，研究激素、暗處理時間與低溫處理溫度對鱗莖誘導(dǎo)效果的影響，為川貝母組培技術(shù)應(yīng)用研究提供參考。方法：通過采用組織培養(yǎng)的方法，比較無菌處理的外植體在不同培養(yǎng)方式中的生長情況，并簡要分析川貝母組織培養(yǎng)的影響因素。結(jié)果：低溫暗處理，GA3均有利于打破鱗莖休眠，加快分化速度，同時GA3有提高愈傷組織誘導(dǎo)率的效果；這批試驗樣本中，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為80.2%，不定芽誘導(dǎo)率最高為79.3%。結(jié)論：誘導(dǎo)生成不定芽的最佳激素配比為6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1，誘導(dǎo)鱗莖生成愈傷組織的最佳激素配比為6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1；低溫暗處理誘導(dǎo)鱗莖分化效果最佳的組合為4 ℃+5 d。

川貝母；鱗莖；組織培養(yǎng)；影響因素；應(yīng)用

川貝母（Fritillaria cirrhosa）為百合科植物，在云南、四川等地有栽培。其鱗莖有清熱潤肺，化痰止咳，祛瘀解結(jié)、降壓解痙等功效[1]。川貝母對于生長環(huán)境要求較高，野生植株相對較少，由于其藥用價值極高，近年來遭到人們大量采挖，造成了野生資源的極其匱乏?，F(xiàn)在部分地區(qū)開始采用人工種植的方式來解決此問題，然而其繁殖系數(shù)小、發(fā)育周期長、種植成本高等因素大大的降低了此方法的可行性[2]。

近年來，組織培養(yǎng)技術(shù)的成功應(yīng)用有望解決貝母資源匱乏的問題。根據(jù)現(xiàn)有資料，外植體再生鱗莖最普遍的處理是將外植體接入培養(yǎng)基讓其表面直接長出小鱗莖或小芽，在短時間內(nèi)可以得到大量的鱗莖[3]。郭生楨等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)5種貝母的幼鱗片誘導(dǎo)率最高[4]。目前關(guān)于川貝母的組織培養(yǎng)研究尚未系統(tǒng)進行，因此，針對現(xiàn)有研究空白，本實驗研究了關(guān)于川貝母組織培養(yǎng)的一些影響因素并做簡要分析，為川貝母后續(xù)研究提供參考，以期進一步推動川貝母資源的開發(fā)利用。

1 材料、儀器、試劑

1.1 材料

樣品采自甘孜州康定市，采集時間為出苗盛期，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院裴瑾教授鑒定為川貝母（Fritillaria cirrhosa）。

1.2 儀器

HIRAYMA HVE-50滅菌器（華粵行儀器有限公司）、1300系列A2生物安全柜（賽默飛世爾科技公司）、JA2003B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、QHZ-98B全溫度光照振蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠）、智能人工氣候箱RTOP-280B（浙江托普儀器有限公司）。

1.3 試劑

MS培養(yǎng)基（批號20160815001，杭州百思生物技術(shù)有限公司）、6-芐基腺嘌呤（批號20150611，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、α-萘乙酸（批號20150617，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、赤霉素（批號20150519，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、蔗糖（CAS：57-50-1，成都市科龍化工試劑廠）、瓊脂（CAS：9002-18-0，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），無水乙醇（CAS：64-17-5，成都科隆化學(xué)品有限公司）。

2 實驗方法

2.1 無菌處理

自來水沖洗材料2小時，刷洗掉表面的土壤雜質(zhì)。選取顏色、質(zhì)地相對一致的鱗莖外表基部，然后切成約6 mm 厚的小塊作為外植體。首先將材料在75%酒精中浸泡1 min，再轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞溶液中浸泡10 min，最后在無菌水中清洗2～3次后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中。

2.2 培養(yǎng)基制備

培養(yǎng)基配制為組織培養(yǎng)過程中非常重要的過程，根據(jù)現(xiàn)有報道分析，最適宜貝母生長的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，特別對于種胚成苗的高生長促進效果方面表現(xiàn)突出[5]，本文采用培養(yǎng)基為MS 4.74 g﹒L-1+蔗糖30 g﹒L-1+瓊脂4 g﹒L-1+活性炭0.3 g﹒L-1+激素。培養(yǎng)基配制好后，分裝至培養(yǎng)瓶內(nèi)，121 ℃ 滅菌20分鐘后放入超凈工作臺至凝固備用。

2.3 培養(yǎng)條件

溫度、光照、濕度等為植物組織培養(yǎng)中的重要因素，其中溫度和光照是這2種環(huán)境因子不僅影響細胞增殖和器官分化,而且對次生產(chǎn)物的形成有很大的影響[6]，考慮川貝母生長的特殊環(huán)境，本研究在李旦[7]等相關(guān)報道的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化處理，光照強度2200 lx，光照16 h，暗培養(yǎng)8 h，散射光培養(yǎng)18 ℃ ± 1 ℃，濕度為49% RH。

2.4 激素的處理方式

2.4.1激素初始篩選 首先用6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）組合方式進行篩選確定激素使用范圍，每種激素選取相同的6種濃度，即0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，每種組合做三次重復(fù)，培養(yǎng)觀察，組合方式見表1。

表1 激素篩選方式

2.4.2激素正交設(shè)計 根據(jù)2.3.1的結(jié)果刪除初始設(shè)計濃度3.0 mg﹒L-1，將GA3（赤霉素）、6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）按照正交方法設(shè)計實驗[8]，GA3的設(shè)計水平為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，具體信息見表2。

表2 激素正交設(shè)計方案

2.5 培養(yǎng)方式

以往報道提出低溫和暗處里均可以打破貝母鱗莖休眠，加快分化速度，根據(jù)已有研究，本文選出2.3.1中愈傷組織誘導(dǎo)率及不定芽誘導(dǎo)率最高的兩組激素組合進行不同的低溫暗處理培養(yǎng)，處理方式見表3。

表3 低溫暗處理方式

3 結(jié)果與分析

觀察在不同的培養(yǎng)方式下組織的生長情況，不定芽與愈傷組織分別見圖1-A、1-B。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有GA3的對照組和經(jīng)過低溫暗處理的對照組分化速度明顯快于只含NAA、6-BA的實驗組，而且含GA3的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率明顯提高。35天后（不包括低溫暗處理時間）對川貝母生長情況進行統(tǒng)計，在不含在有GA3的培養(yǎng)基中，激素組合6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1能夠很好誘導(dǎo)不定芽生長，激素組合6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1能夠較好誘導(dǎo)愈傷組織的形成；添加GA3后，6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+ GA3 0.5 mg·L-1 的培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率最高，其不定芽誘導(dǎo)率達到60.5%，但是低于此培養(yǎng)基不加GA3時的不定芽誘導(dǎo)率，推測GA3 有抑制不定芽發(fā)育的效果；誘導(dǎo)鱗莖生成愈傷組織的最佳激素配比為6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1；低溫暗處理誘導(dǎo)效果最佳的組合為4 ℃+5 d。6-BA+NAA、6-BA + NAA + GA3、6-BA+ NAA+低溫暗處理 這3種方式的最佳處理結(jié)果見表4。

圖1 川貝母在不同環(huán)境的生長情況

表4 三種方式最佳處理結(jié)果

愈傷形成率（%）=（長有愈傷組織的外植體數(shù) /全部的外植體數(shù)）×100%

不定芽形成率（%）＝（產(chǎn)生芽的外植體數(shù) / 全部外植體數(shù)）×100%（同時形成不定芽和愈傷的材料也納入統(tǒng)計）

4 討論

4.1 激素的影響

植物組織培養(yǎng)與多種激素同時存在關(guān)系，本實驗在研究不同因素對川貝母分化效果比較的過程中發(fā)現(xiàn)，GA3不僅可以打破鱗莖休眠，加快分化速度，還能誘導(dǎo)材料形成愈傷組織，這與樊軍[9]、熊增芳[6]等的報道相似，由此推測GA3本身或者與其它激素結(jié)合使用時有提高愈傷組織誘導(dǎo)率的效果。誘導(dǎo)生成不定芽的最佳激素配比為6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1，6-BA與 NAA濃度比為4：1，沈海龍[10]指出當(dāng)細胞分裂素與生長素比例較高時利于芽的分化的結(jié)論與本實驗結(jié)果吻合。研究發(fā)現(xiàn)[11]，植物體內(nèi)的細胞分裂素由5，-腺苷單磷酸（5，-AMP）與二甲基丙烯基（DMAPP）經(jīng)過一系列酶催化反應(yīng)得到，中間會產(chǎn)生核糖、磷酸基團等物質(zhì)，同時伴隨著一系列酶的失活與活化，這些物質(zhì)都有可能引起組織體內(nèi)基因的表達，如果使用不同濃度的激素時，產(chǎn)生的效果自然不同。關(guān)于生長素的研究報道甚少，不過已有研究證明生長素可以作用位于質(zhì)膜上的H+-ATP酶（P型ATP酶），這個酶能通過酸化質(zhì)外體來增加細胞壁的伸展。目前植物激素對于其生長的詳細調(diào)控機制尚未研究清楚，例如細胞分裂素和生長激素一起使用可以促進細胞的分裂也會影響植物細胞的分化，同時激素之間的相互作用機制也非常復(fù)雜。但值得一提的是，通過不斷的實驗研究可以找到最佳的貝母組織培養(yǎng)方案，為后續(xù)研究提供參考。

4.2 低溫黑暗的影響

大量研究表明，黑暗和光照條件下低溫處理植物對其代謝機制有重大影響，植物激素及其它內(nèi)源性物質(zhì)在低溫黑暗環(huán)境下所起的作用和含量都會發(fā)生變化。例如常見的生長抑制激素脫落酸，相關(guān)報道指出其代謝變化與低溫信號存在密切聯(lián)系[12]，此外，對于低溫誘導(dǎo)組織萌發(fā)或開花有研究者認(rèn)為是赤霉素參與了成層以及春化過程[11]，因為不經(jīng)過冷處理而直接施加赤霉素也可以獲得同樣的效果，但是目前仍未搞清赤霉素介導(dǎo)了溫度刺激的原因。李招弟在紅花幼苗研究中發(fā)現(xiàn)，低溫暗處理的幼苗的生理指標(biāo)與對照組相比差異明顯[13]，結(jié)果證明低溫黑暗處理確實對植物自身調(diào)節(jié)的影響較大。因此，若在鱗莖培養(yǎng)初始階段設(shè)置一個低溫黑暗的信號，該信號通過影響植物代謝過程而改變某些物質(zhì)的含量和活性，再加上合適的生長環(huán)境，鱗莖做出應(yīng)答的速度和概率都會提高。這與貝母鱗莖長期生長在地表以下，幾乎不見光照的生活環(huán)境也是密切相關(guān)的。

近年來，關(guān)于川貝母的組織培養(yǎng)研究尚未系統(tǒng)進行，例如內(nèi)源與外源激素之間的聯(lián)系、激素種類等方面的研究尚未進行，大多研究僅僅針對分化的某個環(huán)節(jié)，對于外植體的前期處理研究更是甚少。本研究將激素與低溫黑暗處理等因素同時結(jié)合起來考慮有望成為川貝母組織培養(yǎng)的研究熱點，一旦川貝母的組織培養(yǎng)技術(shù)能夠全面應(yīng)用，將會很大程度上推動農(nóng)業(yè)經(jīng)濟以及醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展。

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Study on the influencing factors of Chuanbeimu tissue culture/

WANG Wei, ZHANG Da-yan,WEN Huan, WANG Qihao, PENG Cheng, GAO Ji-hai//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: With Chuanbeimu bulb appearance base as the materials, the effects of hormone, dark processing and low temperature on the bulb was investigated to provide a reference for the tissue culture technology of Chuanbeimu. Method:Using tissue culture method, the growth conditions of explants in different culture medium were compared and the influence factors of Chuanbeimu tissue culture was analyzed. Result: Low temperature, dark environment and GA3 were conductive to break the dormancy of the bulb and accelerate the differentiation rate. GA3 also improved the frequency of callus induction. In these samples, the highest frequency of callus induction was 80.2%, and the highest rate of adventitious buds inductivity was 79.3%.Conclusion:The best hormone combination for inducing buds from bulb is 6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1. The best hormone combination for inducing callus formation from bulb is 6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1. The optimum combination of low temperature and dark environment for inducing bulb is 4 ℃ +5 d.

Chuanbeimu; bulb; tissue culture; in fl uence factor; application

R 282.2

A

1674-926X(2017)04-001-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

王偉（1995-），男，在讀學(xué)士，研究方向：生藥學(xué) Tel：18980924453 Email：1185213978@qq.com

高繼海（1983-），男，博士，研究方向：分子生藥學(xué) Tel：13709094661 Email：271969318@qq.com

2017-03-17

（責(zé)任編輯： 胡慧玲）