王靈昭，周曉婉，汪維喜，王紀(jì)豐，呂玲玲，舒留泉，姚興存，吳勝軍，焦宇，王玉良

1(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室/海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇 連云港,222005) 2 (連云港西墅物產(chǎn)有限責(zé)任公司,江蘇 連云港,222042)

水不溶性條斑紫菜多糖酸水解的研究

王靈昭1,2*，周曉婉1，汪維喜2，王紀(jì)豐1，呂玲玲1，舒留泉1，姚興存1，吳勝軍1，焦宇1，王玉良1

1(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室/海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇 連云港,222005) 2 (連云港西墅物產(chǎn)有限責(zé)任公司,江蘇 連云港,222042)

小分子多糖水解產(chǎn)物能夠克服大分子多糖溶解性差、生物利用率低的不足。文中對水不溶性條斑紫菜多糖的鹽酸水解進行研究。結(jié)果表明，鹽酸水解多糖的最適條件為，酸濃度0.050 mol/L，溫度80 ℃，時間2.0 h。水解產(chǎn)物中還原糖占總糖的0.24%，低聚糖產(chǎn)物可能為二糖或三糖。產(chǎn)物的紅外光譜分析表明粉狀樣品是含硫酸基的β-糖苷鍵連接的吡喃型低聚糖，其具有糖環(huán)內(nèi)醚結(jié)構(gòu)。產(chǎn)物的紫外光譜分析表明粉狀樣品含有蛋白質(zhì)，進一步分析表明樣品含有蛋白質(zhì)6.88%、總糖88.92%。

條斑紫菜；水不溶性多糖；酸水解；紅外光譜；紫外光譜

干紫菜含25%～50%的蛋白質(zhì)(藻膽蛋白占紫菜干重的4%左右)，20～40%的糖類[1-2]。藻膽蛋白具有抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化、抗衰老等生物活性，在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域具有廣闊的潛在市場[3]。紫菜多糖具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖、抗凝血、消炎、抗疲勞、抗衰老、抗輻射、抗流感病毒、抗癌等生物學(xué)功能，在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[3-5]。因此，從含量及應(yīng)用價值來看，紫菜的高值化利用應(yīng)重點關(guān)注藻膽蛋白和多糖。

目前，對紫菜藻膽蛋白和多糖的開發(fā)，普遍以干紫菜為原料或?qū)Ⅴr紫菜干燥后進一步研究[6-10]。這種作法存在弊端：一是干燥可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性而降低藻膽蛋白的活性；二是10～13 kg的鮮紫菜干燥后僅能得到1 kg干紫菜，且干燥過程會消耗大量熱能。因此，研究以鮮紫菜為原料制備藻膽蛋白和多糖的技術(shù)具有實際意義和價值。筆者提出了一種以鮮紫菜為原料，同時制備藻膽蛋白和多糖的新技術(shù)，但該技術(shù)體系產(chǎn)生水不溶性紫菜多糖[11]。多糖水解產(chǎn)物具有增強免疫、抗腫瘤、降血糖、降血壓、增強機體免疫等生理作用[12]，尤其是其水解產(chǎn)物分子質(zhì)量小的優(yōu)點能夠克服大分子多糖溶解性差、生物利用率低的不足[13]。因此，本文重點研究水不溶性紫菜多糖的酸水解，以開發(fā)條斑紫菜中的水不溶性多糖。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

條斑紫菜(Porphyrayezoensis)：由連云港西墅物產(chǎn)有限責(zé)任公司提供。試劑純度為分析級或更高級。

1.2儀器與設(shè)備

PS100型平板式離心機，張家港市樂余潤捷機械廠；MTK 662型斬拌機，馬多(北京)機械制造有限公司；CMD2000/4高剪切研磨分散機，切可(上海)機械設(shè)備有限公司；MS1001L2K高壓均質(zhì)機，意大利GEA Nliro Soavi公司；CR-22N流體離心機，日本日立儀器有限公司；多用途臺式高速冷凍離心機，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Agileng1200高效液液相色譜儀，安捷倫科技有有限公司；Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測器，美國格瑞斯公司；Nexus-870傅立葉變換紅外光譜儀，美國NICOLET公司；769YP-15A壓片機，北京天創(chuàng)尚邦儀器有限公司；Lambda35紫外/可見分光光度計，美國Perkin Elmer公司。

1.3實驗方法

1.3.1 水不溶性條斑紫菜多糖的制備

以鮮條斑紫菜為原料制備藻膽蛋白和多糖的技術(shù)路線參照前期研究[11]，做如圖1所示的改動。如圖1所示，將采收的條斑紫菜離心脫水后于-20 ℃下凍藏備用。將凍藏紫菜斬拌，加入pH 8.0的KH2PO4-NOH緩沖液(緩沖液/紫菜質(zhì)量比=1/1)于40 ℃下溶脹9 h，用高剪切研磨分散機超微粉碎后加水稀釋(物料/水(質(zhì)量比)=1/1)，然后于80 MPa下高壓均質(zhì)。將均質(zhì)后的物料用流體離心機離心，獲得的沉淀物即為水不溶性紫菜多糖，用于酸水解研究。

圖1 制備藻膽蛋白和多糖的技術(shù)路線Fig.1 Technical route for preparingphycobiliproteins and polysaccharides

1.3.2 紫菜多糖酸水解的影響因素

1.3.2.1 酸濃度對多糖水解的影響

加水稀釋不溶性紫菜多糖的干物質(zhì)含量至3%，然后加入HCl使體系的酸濃度分別達到0.010、0.025、0.050、0.075、0.100 mol/L。體系在75 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH值7.0，離心得上清液，分析上清液中的總糖含量。

1.3.2.2 溫度對多糖水解的影響

加水稀釋不溶性紫菜多糖的干物質(zhì)含量至3%，然后加入HCl使體系的酸濃度達到0.050 mol/L。體系分別在65、70、75、80、85 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，離心得上清液，分析上清液中的總糖含量。

1.3.2.3 時間對多糖水解的影響

加水稀釋不溶性紫菜多糖的干物質(zhì)含量至3%，然后加入HCl使體系的酸濃度達到0.050 mol/L。體系在80 ℃下分別反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，冷卻至室溫，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，離心得上清液，測定上清液中的總糖含量。

以溶出率為指標(biāo)衡量水不溶性紫菜多糖的酸水解，其定義為上清液中總糖含量占所消耗的水不溶性紫菜多糖中干物質(zhì)含量的百分比。

1.3.3 水解率及產(chǎn)物中低聚糖組分分析

測定最適酸水解條件下上清液的還原糖含量，分析水解率。水解率定義為上清液中還原糖含量占總糖含量的百分比。

將上清液樣品真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/5，用4倍體積的95%乙醇醇沉12 h，離心處理去除上清液。添加少量丙酮搖勻后重復(fù)上述操作，再加無水乙醇重復(fù)上述操作。然后，樣品置通風(fēng)櫥中通風(fēng)30 min，于45～55 ℃下干燥后將粉狀樣品置于干燥器中備用。采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法分析粉狀樣品中低聚糖分子質(zhì)量分布，取麥芽糖(Mr=342.30)，葡萄糖(Mr=180.16)作為對照品。色譜條件：ZORBAX NH2色譜柱，柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流動相：V(乙腈)∶V(水)=70∶30，流速1 mL/min； 蒸發(fā)光散射器參數(shù)：漂移管溫度80 ℃，N2流速2.0 L/min。

1.3.4 產(chǎn)物的紅外光譜分析

粉狀樣品的紅外光譜分析采用KBr壓片法，薄片放入紅外光譜儀中進行4 000～400 cm-1范圍的掃描。

1.3.5 產(chǎn)物的紫外光譜、蛋白質(zhì)含量及總糖含量分析

將粉狀樣品配成0.05 g/L樣液，然后用紫外掃描儀進行200～400 nm的掃描。采用Bradford法測定粉狀樣品的蛋白質(zhì)含量。此外，分析粉狀樣品的總糖含量。

1.3.6 化學(xué)及統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1紫菜多糖酸水解的影響因素研究

2.2.1 酸濃度對多糖水解的影響

由圖2可知，酸濃度為0.050 mol/L時溶出率最大，酸濃度為0.075 mol/L時溶出率次之，但兩者的差異不顯著(p>0.05)。但是，酸濃度為0.025或0.100 mol/L時，溶出率均比0.050 mol/L酸濃度時的溶出率顯著降低(p<0.05)。糖類化合物在酸和熱的作用下，能夠發(fā)生復(fù)合和分解反應(yīng)而生成一些非糖類化合物。根據(jù)苯酚硫酸法測總糖的原理，這些反應(yīng)會降低總糖的測定值，因此酸濃度過高會導(dǎo)致溶出率降低。綜合考慮，最適酸濃度為0.050 mol/L。

圖2 酸濃度對多糖水解的影響Fig.2 Effect of acid concentration on polysaccharide hydrolysis注：標(biāo)有不同字母的指標(biāo)值具有顯著性差異(p<0.05)。圖3、圖4同。

2.2.2 溫度對多糖水解的影響

由圖3可知，不超過80 ℃時，溶出率隨著溫度的增加而顯著增加(p<0.05)；85 ℃比80 ℃的溶出率有所增加，但不顯著(p>0.05)。多糖酸水解的溫度過高，反而會導(dǎo)致糖類化合物發(fā)生脫水反應(yīng)，生成糠醛、羥甲基糠醛和酚類等副產(chǎn)物，使總糖收率下降，且溫度過高耗費能量大。綜合考慮，最適溫度為80 ℃。

圖3 溫度對多糖水解的影響Fig.3 Effect of temperature on polysaccharide hydrolysis

2.2.3 時間對多糖水解的影響

由圖4可知，不超過2.0 h時，溶出率隨著時間的增加而顯著增加(p<0.05)；2.5 h比2.0 h的溶出率有所增加，但不顯著(p>0.05)。時間過長，水解液會產(chǎn)生一些非糖類化合物，且糖類化合物容易碳化而導(dǎo)致總糖收率降低。綜合考慮，最適時間為2.0 h。

圖4 時間對多糖水解的影響Fig.4 Effect of time on polysaccharide hydrolysis

2.2水解率及產(chǎn)物中低聚糖組分分析

水解率的分析結(jié)果為(0.24±0.11)%。根據(jù)水解率的定義可知，水解產(chǎn)物的上清液中還原糖含量占總糖含量的百分比為0.24%，還原糖含量較低。水解率較低的原因可能在于水解過程中糖類物質(zhì)的自由醛基或酮基易被氧化所致，也可能在于水解產(chǎn)物多為非還原糖，相關(guān)解釋需要深入研究。

采用高效液相色譜法分析產(chǎn)物中低聚糖組分。如圖5所示，圖5-A和5-B分別是對照品(葡萄糖、麥芽糖)和水解物樣品的色譜圖。由圖5-A可知，葡萄糖和麥芽糖的保留時間分別為10.597 min和12.874 min；由圖5-B可知，水解物樣品僅在13.817 min處出峰，說明產(chǎn)物中低聚糖組分單一。氨基柱已成功地用于低分子糖的分析，乙睛-水作為流動相時的出峰順序為單糖、雙糖和較高聚合度的低聚糖[14]。植物多糖的鹽酸水解得到的寡糖主要為單糖和雙糖，四糖以上的寡糖含量非常低[12]。因此，由圖5中的保留時間可知，產(chǎn)物中低聚糖可能是雙糖或三糖，其結(jié)構(gòu)信息需要深入研究。

圖5 對照品(A)和水解物樣品(B)的高效液相色譜Fig.5 High performance liquid chromatography of control samples (A) and hydrolysate sample (B)

2.3產(chǎn)物的紅外光譜分析

圖6 紅外光譜Fig.6 Infrared spectrum

2.4產(chǎn)物的紫外光譜、蛋白質(zhì)含量及總糖含量分析

由圖7可知，在260～280 nm附近有明顯吸收峰，說明樣品含有蛋白質(zhì)。采用Bradford法測定樣品的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明粉狀樣品含有蛋白質(zhì)(6.88±0.07)%，該結(jié)果驗證了紅外光譜1 655 cm-1處吸收峰表明的是酰胺鍵中N—H鍵的變角振動，其強吸收峰說明了樣品含有較高的蛋白質(zhì)。此外，粉狀樣品含有總糖(88.92±0.49)%。

圖7 紫外光譜Fig.7 Ultraviolet spectrum

3 結(jié)論

采用鹽酸水解水不溶性紫菜多糖，研究了多糖酸水解的影響因素、水解率、低聚糖組成，以及產(chǎn)物的紅外光譜、紫外光譜和蛋白質(zhì)含量等問題。結(jié)果表明，多糖酸水解的最適條件為：酸濃度0.050 mol/L，溫度80 ℃，時間2.0 h。水解產(chǎn)物中還原糖占總糖的0.24%，產(chǎn)物為低聚合度的二糖或三糖。產(chǎn)物的紅外光譜分析表明粉狀樣品是含硫酸基的β-糖苷鍵連接的吡喃型低聚糖，其具有糖環(huán)內(nèi)醚結(jié)構(gòu)。產(chǎn)物的紫外光譜分析表明粉狀樣品中含有蛋白質(zhì)，進一步分析表明樣品含有蛋白質(zhì)6.88%、總糖88.92%。研究工作對高值化開發(fā)條斑紫菜時產(chǎn)生的水不溶性多糖的再利用具有重要價值。

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Investigationofacidhydrolysisofwater-insolublepolysaccharidefromPorphyrayezoensis

WANG Ling-zhao1,2*,ZHOU Xiao-wan1,WANG Wei-xi2, WANG Ji-feng1,LYU Ling-ling1,SHU Liu-quan1,YAO Xing-cun1, WU Sheng-jun1,JIAO Yu1,WANG Yu-liang1

1(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology/College of Marine Life and Fisheries, Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China) 2(Lianyungang Xishu Material Co.,Ltd.,Lianyungang 222042,China)

Small molecular weight hydrolysates from polysaccharide hydrolysis are better than big molecular weight polysaccharides on the solubility and bioavailability. In this work, the hydrolysis of water-insoluble polysaccharides fromPorphyrayezoensiswas investigated using hydrochloric acid method. The optimal conditions for hydrolyzing polysaccharides were determined as: acid concentration 0.050 mol/L, 80 ℃ reacted for 2.0 hours. In the hydrolysates, the ratio of reducing sugar to total sugar was 0.24%, and the oligosaccharide product could be disaccharide or trisaccharide. The infrared spectrum of powder hydrolysates showed they were pyranoses with sulphuric groups, β-glucosidic bonds and cyclic ether structure. The ultraviolet spectrum of powder hydrolysates showed they contained proteins, and further analysis demonstrated the powder hydrolysates contained 6.88% protein, and 88.92% total sugar.

Porphyrayezoensis; water-insoluble polysaccharide; acid hydrolysis; infrared spectrum; ultraviolet spectrum

博士，副教授(本文通訊作者，E-mail：wanglz@hhit.edu.cn)。

連云港市科技項目(CXY1419)；連云港市科技項目(CN1503)

2017-04-13，改回日期：2017-05-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014521