董丹丹 徐 鋼 李芳華 李 科 胥 穎

·基礎(chǔ)研究·

肺腺癌EGFR、KRAS基因突變、ALK融合蛋白狀態(tài)分析

董丹丹 徐 鋼 李芳華 李 科 胥 穎

目的分析肺腺癌中EGFR、KRAS、ALK三種腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的突變狀態(tài)及與其臨床病理特征、腫瘤分期的關(guān)系。方法85例肺腺癌EGFR,KRAS基因突變采用ARMS法檢測(cè)，ALK融合蛋白用特異性抗ALK單克隆抗體(克隆號(hào)：D5F3)采取免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。結(jié)果EGFR,KRAS,和ALK融合蛋白檢測(cè)陽(yáng)性率分別是62%,15%,和14%。EGFR基因突變更常見(jiàn)于女性。KRAS基因突變更常見(jiàn)于男性及有吸煙史患者。ALK融合蛋白更常見(jiàn)于年輕及腫瘤分期Ⅲ/Ⅳ患者。檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了8例雙突變病例。結(jié)論結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了EGFR、KRAS基因突變與ALK融合蛋白并非完全互斥。對(duì)于肺腺癌患者進(jìn)行全面的基因檢測(cè)非常重要，在選擇靶向治療時(shí)更應(yīng)考慮到多種變異同時(shí)存在的情況。

肺腺癌；EGFR；KRAS；ALK

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1393～1397)

肺癌是全世界腫瘤致死的主要原因[1]，中國(guó)每年大約有超過(guò)140萬(wàn)人死于肺癌[2]。傳統(tǒng)的手術(shù)摘除聯(lián)合放療、化療并未使肺癌的生存率有顯著的提高[3]，隨著腫瘤治療進(jìn)入靶向治療時(shí)代，與肺癌發(fā)生及治療相關(guān)的基因包括EGFR基因[4]、KRAS基因[5]及ALK基因等[6]，越來(lái)越受到關(guān)注。

4%的NSCLC患者中存在間變性淋巴瘤激酶ALK重排，這種變異可導(dǎo)致酪氨酸激酶激活，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化密切相關(guān)[7]。

研究顯示非小細(xì)胞肺癌中存在KRAS和EGFR的雙突變[8]，但更多結(jié)果表明KRAS、EGFR突變和間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排是互相排斥的[9]?？梢?jiàn)肺癌多基因的協(xié)同表達(dá)研究結(jié)果還不是十分充分，也沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論。

肺腺癌是肺癌中最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型[10]，本研究檢測(cè)85例肺腺癌4種腫瘤驅(qū)動(dòng)基因EGFR、KRAS、ALK的突變狀態(tài)，并與臨床病理特征、腫瘤分期等之間的關(guān)系進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步揭示其相互關(guān)系，全面 了解肺腺癌的相關(guān)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因之間的內(nèi)在聯(lián)系，以指導(dǎo)臨床治療。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2014年至2016年四川省人民醫(yī)院病理科85例病理診斷為浸潤(rùn)性肺腺癌樣本，所有病例均經(jīng)兩位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片并診斷，其中男性37例(44%)，女性41例(48%)；中位年齡62.5，年齡<40歲的患者2例(2%)，年齡40～49歲的患者9例(11%)，年齡49～59歲的患者22例(26%)，>60歲的患者47例(55%)；44例(52%)患者無(wú)吸煙史，24例(28%)患者目前或以往吸煙。其中外科手術(shù)標(biāo)本55例，穿刺活檢標(biāo)本30例。

1.2 ARMS法檢測(cè)EGFR、KRAS、BRAF基因突變

5 μm厚的石蠟包埋組織切片38張，置于1.5 ml的EP管內(nèi)。采用QIAGEN公司DNA抽提試劑盒，提取樣本DNA，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA質(zhì)量評(píng)估及濃度調(diào)整：用分光光度計(jì)(3100 pro 型，Amersham Biosciences)檢測(cè)樣本260 nm與280 nm波長(zhǎng)吸光度值，以評(píng)價(jià)其純度及含量。每例樣本所提DNA均符合OD260/OD280在1.8～2.0，用雙蒸水調(diào)整DNA濃度至1.5～3 ng/μl。采用廈門(mén)艾德ADx-ARMSTMEGFR基因突變檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)18～21號(hào)外顯子共21個(gè)突變位點(diǎn)。廈門(mén)艾德ADx-ARMSTMKRAS基因7種突變檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)12號(hào)密碼子和13號(hào)密碼子上7種常見(jiàn)突變。反應(yīng)體系在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增及數(shù)據(jù)采集。

1.3 ARMS法結(jié)果判定

試劑盒采用8聯(lián)PCR管設(shè)計(jì)，每一個(gè)8聯(lián)PCR管檢測(cè)一個(gè)樣品，1～7號(hào)管內(nèi)裝有相應(yīng)EGFR基因突變檢測(cè)和內(nèi)控試劑，突變探針由FAM信號(hào)指示，內(nèi)控由HEX信號(hào)指示。內(nèi)控作為對(duì)試劑、DNA質(zhì)量及操作本身的質(zhì)控，選擇人類EGFR基因相對(duì)保守區(qū)段。待測(cè)樣本的內(nèi)控HEX信號(hào)升起，同時(shí)樣本反應(yīng)管中若有FAM信號(hào)升起，則判定相應(yīng)的EGFR基因突變?yōu)殛?yáng)性。

1.4 Ventana ALK IHC檢測(cè)ALK融合蛋白

準(zhǔn)備未染色并由FISH驗(yàn)證的ALK非小細(xì)胞肺癌患者組織切片，10%中性緩沖福爾馬林液固定6～24 h，每例患者準(zhǔn)備3張空白組織片：一張用于VENTANA ALK(D5F3) 抗體染色，一張用于兔單克隆陰性質(zhì)控抗體染色，一張用于H&E染色。將ALK FISH(+)與ALK FISH(-)切片貼在同一正電荷載玻片上，烤片60度至少1 h。

1.5 Ventana ALK IHC結(jié)果判讀

任何比例的NSCLC腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)棕褐色顆粒狀著色，視為ALK(D5F3)陽(yáng)性。應(yīng)當(dāng)排除已知的非特異性染色，包括肺泡巨噬細(xì)胞中較淡的胞質(zhì)著色，神經(jīng)來(lái)源細(xì)胞(神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)、腺上皮以及浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞及粘液等假陽(yáng)性著色。另外非小細(xì)胞肺癌中正常粘膜(包括粘蛋白)內(nèi)以及壞死組織區(qū)域內(nèi)也可見(jiàn)到背景染色，應(yīng)從臨床評(píng)估中排除。NSCLC腫瘤細(xì)胞內(nèi)不存在強(qiáng)顆粒狀胞質(zhì)染色，視為ALK(D5F3)抗體染色陰性。

肺腺癌組織學(xué)分類根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2015年版肺癌分類進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Fisher's精確檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)(SPSS 10.0版)。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、KRAS、ALK突變情況

85例肺腺癌患者中，EGFR、KRAS、ALK突變情況見(jiàn)表1。EGFR基因突變陽(yáng)性病例中，19號(hào)外顯子缺失突變最常見(jiàn)，共30例檢出19外顯子缺失，占EGFR突變總體的57%，占總病例數(shù)的35%；21號(hào)外顯子突變次之，共23例，占EGFR突變總體的43%，占總病例數(shù)的27%；20號(hào)外顯子(3例，占總病例數(shù)的4%)及18號(hào)外顯子(2例，占總病例數(shù)的2%)突變少見(jiàn)，在EGFR突變總體中的比例<5%；另外5例雙突變病例，占EGFR突變總體的9%，占總病例數(shù)的6%。KRAS基因突變陽(yáng)性病例中，12號(hào)密碼子G12C突變最常見(jiàn)，共6例，占KRAS突變總體的46%；G12V突變次之，共3例，占KRAS突變總體的23%。

2.2 肺腺癌患者是否吸煙與基因突變的關(guān)系(表1)

由表1可見(jiàn)，EGFR基因是否突變與患者吸煙(12/12)和不吸煙(29/15)無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.2001)，KRAS基因突變與患者吸煙與不吸煙存在相關(guān)性(P=0.0044)，ALK融合蛋白與患者吸煙(1/23)和不吸煙(6/38)無(wú)相關(guān)性(P=0.4177)。

2.3 性別與基因突變的關(guān)系

EGFR基因是否存在突變?cè)谂?29/12)和男性(17/20)患者之間存在顯著性差異(P=0.0263)，見(jiàn)表1。KRAS基因突變?cè)谂院湍行曰颊咧g也存在顯著性差異(P=0.0084)；ALK融合蛋白，在女性(5/36)和男性(6/31)患者之間卻不存在顯著性差異(P=0.748)，見(jiàn)表1。

2.4 年齡與基因突變的關(guān)系(表1)

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGFR基因突變率在老年患者與年輕患者之間無(wú)顯著差異(P=0.2701)，ALK融合蛋白陽(yáng)性的患者的中位年齡為60歲，ALK融合蛋白陰性患者的中位年齡為63歲，而ALK融合基因則更多常見(jiàn)于年輕患者(P=0.0023)。采用Fisher's 精確檢驗(yàn)，KRAS基因是否突變與患者年齡無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.3533)。

2.5 腫瘤直徑與基因突變的關(guān)系(表1)

EGFR是否存在突變與腫瘤直徑無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.7842)。KRAS基因突變也與腫瘤直徑無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.7223)，ALK融合蛋白同樣與腫瘤直徑無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.5637)。

2.6 基因突變與腫瘤分期的關(guān)系(表1)

由表1可見(jiàn)，EGFR基因是否突變與腫瘤分期不存在顯著相關(guān)性(P=0.4413)，與腫瘤分期也不存在顯著相關(guān)性(P=0.3946)。然而ALK融合蛋白與腫瘤分期存在顯著相關(guān)性(P=0.0043)。

2.7 肺腺癌組織學(xué)類型中黏液成分與基因突變的關(guān)系(表1)

EGFR是否存在突變與肺腺癌組織學(xué)類型中是否含有黏液成分無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.9025)，KRAS基因是否突變與組織學(xué)類型中是否含有黏液成分無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.7261)，ALK融合蛋白與肺腺癌組織學(xué)類型中是否含有黏液成分也不存在顯著相關(guān)性(P=0.7116)。

2.8 肺腺癌組織學(xué)類型中微乳頭成分與基因突變的關(guān)系(表1)

EGFR是否突變與肺腺癌組織學(xué)類型中是否含有微乳頭成分無(wú)顯著相關(guān)性((P=0.8703)，同樣KRAS基因突變與組織學(xué)類型中是否含有微乳頭成分也顯著相關(guān)性(P=0.2696)，ALK融合蛋白與肺腺癌組織學(xué)類型中是否含有微乳頭成分不存在顯著相關(guān)性(P=0.6890)。

表1 EGFR、KRAS基因、ALK融合蛋白表達(dá)情況與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系/例

2.9 EGFR、KRAS、ALK融合蛋白共同變異情況(表2)

85例肺腺癌病例中共檢出8例共同變異病例，其中5例EGFR突變同時(shí)伴有ALK融合蛋白的占研究對(duì)象總體的5.88%(5/85)，占EGFR突變患者的9.43%(5/53)，占ALK融合蛋白陽(yáng)性患者的41.67%(5/12)；1例KRAS突變同時(shí)伴有ALK融合蛋白陽(yáng)性的患者占研究對(duì)象總體的1.18%(1/85)，占KRAS突變患者的7.69%(1/13)，占ALK融合蛋白陽(yáng)性患者的8.33%(1/12)。2例EGFR突變同時(shí)伴有KRAS突變的患者占研究對(duì)象總體的2.35%(2/85)，占EGFR突變患者的3.77%(2/53)，占KRAS突變患者的15.38%(2/13)。

表2 85肺腺癌中8例EGFR、KRAS、ALK共同變異情況

3 討論

EGFR基因突變最常發(fā)生于非吸煙、女性、亞裔、腺癌患者[11]。亞裔腺癌患者中，EGFR突變率高達(dá)30%～50%[12]。本組實(shí)驗(yàn)85例肺腺癌中，EGFR基因突變率為62%，稍高于文獻(xiàn)報(bào)道，可能與檢測(cè)方法的靈敏度不同有關(guān)。女性突變率(71%)高于男性(46%)，二者之間差異具有顯著性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本組實(shí)驗(yàn)中EGFR基因突變?cè)谖鼰熁颊咧懈哌_(dá)50%，提示亞裔肺腺癌有吸煙史的患者中，EGFR基因突變頻率可能比先前報(bào)道的高。EGFR基因突變檢測(cè)應(yīng)該在亞裔肺腺癌患者中更廣泛的開(kāi)展。

本實(shí)驗(yàn)肺腺癌KRAS基因突變率為15%，吸煙患者突變率明顯高于非吸煙患者(33% vs 6%，P<0.05)，KRAS基因12號(hào)密碼子發(fā)生的 G>T 易位導(dǎo)致Gly12Cys突變占50%，與Dogan等[13]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明KRAS基因狀態(tài)的改變可能與煙草中的致癌物質(zhì)有關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)中男性KRAS基因突變(30%)明顯高于女性(5%)，可能是男性吸煙人數(shù)多于女性造成的。

ALK陽(yáng)性肺癌在非小細(xì)胞肺癌中約占3%～6%[14]。本組實(shí)驗(yàn)ALK融合蛋白陽(yáng)性檢出率為14%，高于非小細(xì)胞肺癌患者陽(yáng)性率，其中ALK融合蛋白陽(yáng)性患者的中位年齡為63歲，且更常見(jiàn)于60歲以下及Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌患者，與腫瘤大小無(wú)關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)ALK基因重排陽(yáng)性在含印戒細(xì)胞的粘液型或?qū)嵭苑蜗侔┲懈Ｒ?jiàn)，高于其他類型的肺腺(46.2% vs 8%)。但本組研究中12例肺腺癌ALK融合蛋白陽(yáng)性病例，實(shí)體性腺癌3例，腺泡型腺癌3例，黏液腺癌3例，乳頭型腺癌3例，與是否含有黏液或微乳頭成分無(wú)關(guān)?？梢?jiàn)單純依靠臨床特征與病理分型選擇ALK檢測(cè)的適宜人群，存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。

一些研究顯示，非小細(xì)胞肺癌中EGFR,KRAS和ALK基因的改變多數(shù)表現(xiàn)為互相排斥[15]。然而也有研究顯示EGFR基因突變與ALK基因重排同時(shí)存在[16]?？梢?jiàn)肺癌多基因的協(xié)同表達(dá)，研究還不十分充分，也沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論。

本研究分別檢出5例EGFR突變伴ALK融合蛋白陽(yáng)性，1例KRAS突變伴ALK融合蛋白陽(yáng)性，2例EGFR突變伴KRAS突變。結(jié)果顯示ALK融合蛋白陽(yáng)性伴隨有EGFR或KRAS突變的病例在肺腺癌中并不罕見(jiàn)。Gainor等研究西方人群非小細(xì)胞肺癌患者，發(fā)現(xiàn)ALK基因重排與EGFR和KRAS基因突變互相排斥[17]，與本研究結(jié)果不同，說(shuō)明不同人種基因狀態(tài)存在差異。

本組研究中12例ALK融合蛋白陽(yáng)性病例，5例(41.67%)伴隨EGFR基因突變((19DEL，S768I，L858R)，1例(8.33%)伴隨KRAS基因突變(Gly12Asp)。EGFR突變伴隨有ALK融合蛋白陽(yáng)性，與KRAS突變伴隨有ALK融合蛋白陽(yáng)性在ALK融合蛋白陽(yáng)性肺腺癌中誰(shuí)更占優(yōu)勢(shì)，還需要更多的數(shù)據(jù)支持。

對(duì)于具有EGFR基因突變及ALK融合蛋白陽(yáng)性的病例，多項(xiàng)研究顯示，采用TKI治療表現(xiàn)為臨床獲益，采用克唑替尼治療也表現(xiàn)出良好的治療反應(yīng)性[18]。但也有體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變與ALK基因重排同時(shí)存在，可能導(dǎo)致分別針對(duì)EGFR和ALK兩個(gè)靶點(diǎn)的單藥TKI治療相互耐藥[19]。這可以可能是具有ALK融合基因的患者采用克唑替尼治療約20%～30%的患者缺乏治療反應(yīng)性的原因。

本組實(shí)驗(yàn)檢出2例EGFR突變伴隨KRAS突變的肺腺癌病例，約占2.35%，在EGFR突變的肺腺癌患者中較罕見(jiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道此類患者從TKI的治療中獲益較小，并且顯示出了不良預(yù)后[20]。

了解基因的協(xié)同作用及改變可以幫助我們理解腫瘤患者采用靶向治療時(shí)出現(xiàn)的原發(fā)耐藥機(jī)制，同時(shí)指導(dǎo)臨床轉(zhuǎn)換或調(diào)整針對(duì)ALK和EGFR、KRAS基因的靶向治療方案，為臨床采用多種靶向藥物聯(lián)合使用以達(dá)到阻斷多條腫瘤信號(hào)通路的目的提供依據(jù)。多基因協(xié)調(diào)作用的肺癌患者的治療方案的選擇及效果的觀察還需要更多的研究證實(shí)。

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(編輯：吳小紅)

InvestigationofEGFR、KRASMutationsandALKProteinFusionStatusinLungAdenocarcinomaPatients

DONGDandan,XUGang,LIFanghua,etal.

SichuanAcademyofMedicalSciences,SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu,610072

ObjectiveTo evaluate the mutations of EGFR,KRAS,ALK fusion protein and their relations with clinical pathological features and stages of lung adenocarcinoma.MethodsIn a cohort of patients with lung adenocarcinoma (n=85),EGFR,KRAS mutations were detected by amplification refractory mutation system in multiple quantitative polymerase chain reaction (ARMSmultiq PCR).ALK fusion protein was screened using immunohistochemistry (IHC) conducted with an anti-ALK monoclonal antibody (clone D5F3,Ventana).ResultsThe mutation rate was 62%,15%,14% for EGFR,KRAS,ALK fusion protein in 85 lung adenocarcinoma cases,respectively.EGFR mutations were more frequently observed in female patients.KRAS mutations were more frequently detected in male patients,and smokers.ALK fusion protein was more frequently observed in younger patients,and 3/4 patients.8 cases of co-mutationswere detected.ConclusionWe have further confirmed that EGFR,KRAS mutations and ALK fusions are not mutually exclusive through the analysis of 85 lung adenocarcinoma cases.It is vital for a complete molecular analysis to be performed on all lung adenocarcinoma patients,and the possibility of multiple mutations must be taken into account when choosing targeted therapy.

Lung adenocarcinoma；EGFR；KRAS；ALK

四川省衛(wèi)生廳課題基金項(xiàng)目(編號(hào)：120080)

610072 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.001

R734.2

A

1001-5930(2017)09-1393-05

2016-09-08

2017-07-10)