徐偉莉 牛保華

Mcl-1與高爾基體磷酸化蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與其臨床病理特征的關(guān)系

徐偉莉 牛保華

目的探究髓細(xì)胞白血病-1(Mcl-1)與高爾基體磷酸化蛋白(Golph3)在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平及與其臨床病理特征的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化方法，檢測(cè)60例結(jié)腸癌組織中Mcl-1、Golph3表達(dá)水平，并與其癌旁正常組織中的表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果Golph3、Mcl-1在正常組織及結(jié)腸癌組織中均有表達(dá)，然而在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)；Mcl-1表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期密切相關(guān)，浸潤(rùn)程度大，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中Mcl-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著較高(P<0.05)；Golph3水平與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，浸潤(rùn)程度大，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中Golph3陽(yáng)性表達(dá)率明顯較高(P<0.05)。結(jié)論Mcl-1、Golph3參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，與正常組織相比其表達(dá)量顯著升高，且與腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期等病理參數(shù)密切相關(guān)。

結(jié)腸癌；Mcl-1；Golph3；免疫組化；臨床病理

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1420～1422)

結(jié)腸癌是好發(fā)于直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處的腫瘤。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)腸癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第二[1]；在我國(guó)，隨著社會(huì)環(huán)境、生活方式(飲食習(xí)慣，缺乏運(yùn)動(dòng))的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且具有高致死率。其致死率在男性中位居第五，在女性中位居第六[2]。與其他惡性腫瘤類似，結(jié)腸癌具有生長(zhǎng)迅速，浸潤(rùn)性強(qiáng)且易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，這也是其難治愈病死率高的重要原因。根治性手術(shù)輔助以放化療是目前而言治療結(jié)腸癌的主要臨床手段，然而不可避免的會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，造成預(yù)后不良[3-5]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程受多種基因的調(diào)控，相應(yīng)的蛋白水平表達(dá)異常也與腫瘤活動(dòng)密切相關(guān)。因此，積極探究參與結(jié)腸癌病理過(guò)程中的蛋白分子的表達(dá)情況及其對(duì)病理參數(shù)的影響對(duì)于結(jié)腸癌的分子靶向治療有著重要的意義。已有研究報(bào)道，Mcl-1是新近發(fā)現(xiàn)的屬于bcl-2家族的凋亡控制基因，其表達(dá)量下調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示Mcl-1可能是治療腫瘤的新靶點(diǎn)[3,6]。高爾基體磷酸化蛋白是一類功能強(qiáng)大的癌基因，在肺癌、胃癌中均已證實(shí)其高表達(dá)與腫瘤增殖活動(dòng)密切相關(guān)[7]。本研究采用免疫組化方法探究結(jié)腸癌患者組織Mcl-1與高爾基體磷酸化蛋白表達(dá)水平與臨床病理之間的相關(guān)性，以期為結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制、早期診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集我院2006年2月至2016年2月，收治的60例經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織及距結(jié)腸癌遠(yuǎn)端至少10 cm的癌旁正常組織(鏡下診斷無(wú)癌組織浸潤(rùn))，其中男性37例，女性23例，平均年齡(58.69±5.4)歲；所有患者的手術(shù)標(biāo)本均在離體30 min內(nèi)采集，于液氮中儲(chǔ)存。TNM分期參考美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)或國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的結(jié)腸癌分期系統(tǒng)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①所有病例在術(shù)前均未行放化療。②病例資料完整，均與家屬簽署知情同意書(shū)。該研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué) 采用免疫組化SP法，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。4 μm連續(xù)切片后68 ℃烤片20 min，常規(guī)使用二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶之后使用0.01 M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)行抗原修復(fù)。在玻片標(biāo)本組織上滴加已稀釋好的一抗(兔抗人Mcl-1單克隆抗體，編號(hào)：AF0094，生產(chǎn)廠家：Affinity公司；兔抗人Golph3單克隆抗體，編號(hào)：ab98023，生產(chǎn)廠家：ABCAM公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。復(fù)溫1 h后加通用型生物素化二抗室溫孵育30 min，之后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素于37 ℃孵育30 min。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，脫水并封片。

1.3.2 結(jié)果判定 Mcl-1蛋白染色與高爾基體磷酸化蛋白(Golph3)染色以細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核中出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分，兩者得分相乘，總分≤4分為陰性表達(dá)，總分>4分為陽(yáng)性。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色計(jì)0分；淡黃色1分；棕色2分；棕褐色3分；陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：隨機(jī)選取5個(gè)視野，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%計(jì)0分；5%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；>50%計(jì)3分。由兩名病理科副主任醫(yī)師獨(dú)立閱片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)對(duì)比分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mcl-1、Golph3表達(dá)水平在結(jié)腸癌組織及正常癌旁組織中的差異

免疫組化結(jié)果顯示：Golph3、Mcl-1在正常組織及結(jié)腸癌組織中均有表達(dá)，然而結(jié)腸癌組織中其陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 Mcl-1、Golph3在不同組織中表達(dá)水平差異(例，%)

2.2 Mcl-1、Golph3表達(dá)水平與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Mcl-1表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期密切相關(guān)，浸潤(rùn)深度深，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中Mcl-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著較高(P<0.05)；Golph3水平與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，浸潤(rùn)深度深，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中Golph3陽(yáng)性表達(dá)率明顯較高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

近年來(lái)結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年升高，其合并易轉(zhuǎn)移易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)使得通過(guò)手術(shù)切除治療的臨床效果不佳，如何早期診斷及控制結(jié)腸癌的發(fā)展一直是臨床醫(yī)師面臨的難點(diǎn)。目前，關(guān)于腫瘤的分子靶向治療是該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。惡性腫瘤增殖過(guò)程中，常伴隨一些原癌基因的激活或者抑癌基因的失活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白的異常表達(dá)[6,8]。因此，探索腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中蛋白的表達(dá)變化，對(duì)于腫瘤的靶向治療及臨床預(yù)測(cè)均有積極的意義。本文采用免疫組化方法探究結(jié)腸癌患者組織Mcl-1與Golph3表達(dá)水平與臨床病理之間的相關(guān)性，研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中Mcl-1與Golph3的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常癌旁組織，提示Mcl-1、Golph3參與了結(jié)腸癌病變的生理過(guò)程。為了進(jìn)一步探究其在結(jié)腸癌中的作用，我們分析了Mcl-1、Golph3表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示：Mcl-1表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性，與腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期密切相關(guān)，浸潤(rùn)程度大，臨床分期Ⅲ、Ⅳ的結(jié)腸癌組織中Mcl-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著較高；Golph3水平與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，浸潤(rùn)程度大，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中Golph3陽(yáng)性表達(dá)率明顯較高。

表2 Mcl-1、Golph3表達(dá)水平與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

髓細(xì)胞白血病基因-1(Mcl-1)是細(xì)胞凋亡控制蛋白，其主要作用機(jī)制為：維持線粒體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞生存，在細(xì)胞毒制劑等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的條件下可通過(guò)螯合促凋亡蛋白Bax/Bak而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，還可與增殖細(xì)胞核抗原相互作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞分化過(guò)程[7,9]。已有較多報(bào)道證實(shí)在白血病、肝癌、宮頸癌中都存在Mcl-1過(guò)表達(dá)。另外，F(xiàn)leischer等[10]在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)高水平的Mcl-1，在采用特異性抑制劑(LY294002)后，Mcl-1水平迅速下調(diào)，并且提高了化療藥物的敏感性，提示Mcl-1是肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。高爾基體磷酸化蛋白(Golph3)是位于高爾基體的膜蛋白，在維持高爾基體結(jié)構(gòu)，蛋白糖基化等過(guò)程中具有重要的作用，研究顯示在癌細(xì)胞中蛋白糖基化過(guò)程紊亂，這可能與腫瘤增殖、黏附、遷移和浸潤(rùn)有關(guān)[11-12]。在正常組織中Golph3的表達(dá)量較低，然而在胃癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等病變中檢測(cè)到Golph3表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，Mcl-1、Golph3參與于結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，與正常組織相比其表達(dá)量顯著升高，且與腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期等病理參數(shù)相關(guān)。

[1] Tárraga López PJ,Albero JS,Rodríguez-Montes JA.Primary and secondary prevention of colorectal cancer〔J〕.Clin Med Insights Gastroenterol,2014,7(2):33-46.

[2] 陳萬(wàn)青,張思維,鄭榮壽,等.中國(guó)2009年惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析〔J〕.中國(guó)腫瘤,2013,22(1):2-12.

[3] 陳文娟,袁長(zhǎng)吉,劉 念,等.抗凋亡基因Mcl-1的研究進(jìn)展〔J〕.吉林醫(yī)學(xué),2010,31(5):669-672.

[4] 張 潔.結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床,2012,12(4):92-94.

[5] 楊 林,王金萬(wàn),張弘剛,等.196例結(jié)腸癌術(shù)后輔助化療療效和預(yù)后因素分析〔J〕.中國(guó)腫瘤臨床,2009,36(7):368-371.

[6] Jamil S,Sobouti R,Hojabrpour P,et al.A proteolytic fragment of Mcl-1 exhibits nuclear localization and regulates cell growth by interaction with Cdk1〔J〕.Biochem J,2005,387(3):659-667.

[7] Scott KL,Kabbarah O,Liang MC,et al.GOLPH3 modulates mTOR signalling and rapamycin sensitivity in cancer〔J〕.Nature,2009,459(7250):1085-1090.

[8] Phang CW,Karsani SA,Sethi G,et al.Flavokawain C inhibits cell cycle and promotes apoptosis,associated with endoplasmic reticulum stress and regulation of MAPKs and akt signaling pathways in HCT 116 human colon carcinoma cells〔J〕.Plos One,2016,11(2):e0148775.

[9] Pennarun B,Kleibeuker JH,Ek BV,et al.Targeting FLIP and Mcl-1 using a combination of aspirin andsorafenib sensitizes colon cancer cells to TRAIL〔J〕.J Pathol,2013,229(3):410-421.

[10] Fleischer B,Schulze BH,Schuchmann M,et al.Mcl-1 is an anti-apoptotic factor for human hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Oncol,2006,28(1):25-32.

[11] 何欣欣,吳東霞,陳耿標(biāo),等.結(jié)直腸癌組織中高爾基體磷酸化蛋白的表達(dá)與患者中遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系〔J〕.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2016,26(7):989-991.

[12] 余外市.結(jié)直腸癌組織中Golph3表達(dá)的臨床意義〔D〕.福建醫(yī)科大學(xué),2014.

(編輯：吳小紅)

ExpressionofMyeloidLeukemia-1 (Mcl-1)andGolgiPhosphorProtein(Golph3)inColonCarcinomaandItsRelationshipwithClinicalPathologicalFeatures

XUWeili,NIUBaohua.

XinxiangSecondPeople'sHospital,Xinxiang,453002

ObjectiveTo investigate the expression of myeloid leukemia-1 (Mcl-1) and Golgi phosphor protein (Golph3) in colon carcinoma and its relationship with clinical pathological features.MethodsThe expression level of Mcl-1 and Golph3 in 60 cases of colon cancer tissues were detected using immunohistochemical method,and compared with adjacent normal tissues.ResultsMcl-1 and Golph3 in normal tissues and colorectal cancer tissues were expressed,but in colon cancer tissues the positive expression was significantly higher than normal tissues (P<0.05);there was no significant difference between the expression level of Mcl-1 in patients and gender,age,tumor differentiation,lymph node metastasis (P>0.05).But the expression level of Mcl-1 in patients was closely related to the clinical stage,the depth of tumor invasion.The positive expression rate of Mcl-1 in colon cancer with clinical stage Ⅲ，Ⅳ and depth of tumor invasion was significantly higher (P<0.05).The expression level of Golph3 was related to infiltration depth and lymph node metastasis,while Golph3 has significantly higher expression in lymph node metastasis tissues and the large degree of invasion (P<0.05).ConclusionMcl-1,Golph3 are involved in the process of development colon cancer,and the expression significantly increased compared with the normal tissue,which are related to distal metastasis tumor,lymph node metastasis,clinical stage,pathology the parameters.

Colon carcinoma;Myeloid leukemia-1(Mcl-1);Golgi phosphor protein (Golph3);Immunohistochemical;Clinical pathological

453002 河南省新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院(徐偉莉)；475004 河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院(牛保華)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.007

R735.3+5

A

1001-5930(2017)09-1420-03

2016-11-08

2017-07-10)