申炳俊 金麗虹 劉昱鑫 柴 浩 劉占偉 劉榮娟 田 堅*

(長春理工大學(xué)清潔能源技術(shù)研究所1, 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2, 長春 130022)

熒光光譜結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜法研究紫檀芪與人血清白蛋白相互作用

申炳俊1金麗虹*2劉昱鑫2柴 浩2劉占偉2劉榮娟2田 堅*1

(長春理工大學(xué)清潔能源技術(shù)研究所1, 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2, 長春 130022)

在模擬人體生理條件下，應(yīng)用熒光光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜法研究了紫檀芪(PTE)與人血清白蛋白(HSA)之間相互作用機(jī)制。結(jié)果表明，HSA的熒光能被PTE靜態(tài)猝滅，并伴隨有非輻射能量轉(zhuǎn)移作用，兩者形成了1∶1復(fù)合物，結(jié)合距離r=1.495 nm，結(jié)合常數(shù)KA=1.12 × 104(298 K)、4.07 × 104(304 K)和2.45 × 105L/mol (310 K)。表面增強(qiáng)拉曼光譜研究揭示, PTE分子通過甲氧基與HSA進(jìn)行結(jié)合; 熱力學(xué)數(shù)據(jù)表明,二者間的作用主要為疏水作用; 標(biāo)記競爭實驗指出PTE優(yōu)先結(jié)合HSA的位點Ⅲ。三維熒光光譜、同步熒光光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜結(jié)果顯示，與PTE作用后，HSA構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致色氨酸殘基周圍環(huán)境疏水性降低，但對PTE分子構(gòu)象影響不大。

紫檀芪; 人血清白蛋白; 熒光光譜; 表面增強(qiáng)拉曼光譜; 構(gòu)象變化

2017-05-29收稿; 2017-07-19接受

本文系國家自然科學(xué)基金(No.21153003)、 吉林省教育廳項目(No.201574)和長春理工大學(xué)博士后基金項目(2014年)資助

* E-mail: jinlh@cust.edu.cn; tianjian@cust.edu.cn

1 引 言

紫檀芪(Pterostilbene，PTE)化學(xué)名稱為3，5-二甲氧基-4′-羥基反式二苯乙烯，是白藜蘆醇(Resveratrol， RES)的甲基化衍生物。PTE廣泛存在于葡萄、藍(lán)莓和西紅柿等水果和蔬菜中，是一種天然的含有芪結(jié)構(gòu)非黃酮類多酚化合物。近年來，PTE的廣泛生物活性引起了研究人員的關(guān)注，PTE不僅具有抗心血管疾病、抗炎、抗氧化、降血糖等藥理活性[1～3]，還對食道癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和惡性黑素瘤等多種腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用[4～6]。研究表明，在同等情況下，PTE的某些生物活性、生物利用度和安全性高于同源物RES[7]。目前，對于PTE藥理作用研究多集中于生物學(xué)活性。然而，藥物的臨床效果通常與抑制類型、藥物的吸收、體內(nèi)的分布與組織濃度及消除方式等藥代動力學(xué)有關(guān)。因此，開展PTE藥動力學(xué)研究，將有助于PTE的開發(fā)和應(yīng)用。

人血清白蛋白(HSA)是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，其表面具有親脂性的結(jié)合位點，可與多種內(nèi)源和外源性化合物結(jié)合，是體內(nèi)重要的載體[8]。藥物分子進(jìn)入人體內(nèi)后，一般無法直接作用于病灶部位，通常與HSA以非共價方式結(jié)合進(jìn)行運輸，藥物與HSA的親和性將直接影響其釋放、代謝和生物活性。因而HSA常被用作研究藥物小分子與蛋白質(zhì)相互作用的模型蛋白。目前，與蛋白質(zhì)相互作用研究多集中于黃酮類和生物堿類活性成分，而萜類、蒽醌類、多酚類、香豆素類及醌類活性成分研究相對較少。光譜法作為研究藥物與蛋白質(zhì)相互作用的一種常用且有效的方法，被廣泛應(yīng)用于中藥活性成分與HSA結(jié)合作用研究中。曹團(tuán)武等[9]利用熒光光譜結(jié)合紫外吸收光譜研究了環(huán)烯醚萜類化合物哈巴俄苷與HSA的結(jié)合反應(yīng)，獲得了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)等信息。吳秋華等[10]利用熒光光譜和吸收光譜法從分子水平研究了萜類化合物RES與HSA的相互作用。Maya等[11]利用熒光光譜、吸收光譜和紅外光譜結(jié)合分子模擬技術(shù)對比分析了PTE、RES與HSA的相互作用，得到了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、結(jié)合距離、具體結(jié)合位置和結(jié)合力等信息，但未對PTE與HSA兩者間相互作用的化學(xué)鍵進(jìn)行實驗驗證，而且兩者結(jié)合對PTE構(gòu)象的影響也未提及。

本研究利用密度泛函理論(DFT)獲得PTE分子構(gòu)象和理論拉曼光譜信息，在詳細(xì)歸屬PTE拉曼特征峰基礎(chǔ)上，通過PTE與HSA結(jié)合前后SERS光譜變化情況探討兩者間化學(xué)鍵結(jié)合方式以及構(gòu)效關(guān)系。同時在模擬人體生理條件下，利用熒光光譜法對PTE與HSA相互作用機(jī)理進(jìn)行研究。本研究對于闡明PET構(gòu)效關(guān)系、藥代動力學(xué)、指導(dǎo)臨床合理用藥以及PET的開發(fā)及利用等均具有重要參考意義。

2 實驗部分

2.1儀器與試劑

F-280型熒光分光光度計(中國天津港東公司); QE65000型激光拉曼光譜儀(美國Ocean Optics公司); DELTA320型pH計(瑞士Mettler Toledo公司); DC-4006型高精度水浴(上海菁海儀器公司)。人血清白蛋白(HSA，Sigma公司)，使用時用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液配成1.00 × 10mol/L儲備液。紫檀芪(PTE，純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司); 保泰松(Phenylbutazone)、布洛芬(Ibuprofen)、洋地黃毒苷(Digitoxin)，純度≥98%(德國Dr. Ehrenstorfer公司)。上述標(biāo)準(zhǔn)品均用無水乙醇配制成2.00 × 10mol/L溶液，儲備液及溶液均于4℃下避光保存。其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2實驗方法

2.2.1熒光光譜和同步熒光光譜在7 mL比色管中加入40 μL HSA儲備液和適量PTE溶液，用Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，獲得HSA: PTE (濃度比)分別為1∶0，1∶1，1∶3，1∶5，1∶7和1∶9混合液，充分混合后，于298 K(304 K或310 K)恒溫水浴中作用30 min。固定激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫寬度為10/5 nm，記錄熒光發(fā)射譜。熒光值用Fcor=Fobs× e(Aex +Aem)/2“內(nèi)濾光效應(yīng)”公式進(jìn)行校正[8]。固定Δλ= 15 nm和Δλ=60 nm(Δλ=λem-λex)，記錄同步熒光光譜。

2.2.2位點競爭實驗HSA和位點標(biāo)記試劑(保泰松/布洛芬/洋地黃毒苷)的濃度均固定為1.0 × 10mol/L，充分混合后，于298 K恒溫水浴中作用30 min，向標(biāo)記試劑-HSA體系中加入適量PTE溶液，混合均勻，繼續(xù)在該溫度水浴中反應(yīng)30 min，測定熒光光譜。

2.2.3三維熒光光譜配制HSA∶PTE(濃度比)為1∶0和1∶6混合液，其激發(fā)波長范圍為200～350 nm，發(fā)射波長范圍為250～700 nm，激發(fā)和發(fā)射波長間隔均為5 nm，掃描三維熒光光譜。

2.2.4DFT理論計算利用密度泛函理論(DFT)，在B3LYP/6-311+ +(d，p)基組水平上優(yōu)化PTE幾何結(jié)構(gòu)，獲得該分子的全部振動頻率。頻率修正因子為0.9613[12]，所有計算均采用Guassian 09程序完成。

2.2.5拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜將PTE固體標(biāo)樣置于載玻片上，進(jìn)行普通拉曼光譜(NRS)測試。配制HSA與PTE終濃度比分別為0∶1，1∶0和1∶2的混合液，pH 7.4 條件下作用30 min進(jìn)行藥物與HSA識別; 與等體積銀溶膠溶液(由經(jīng)典的Lee法[13]制備銀溶膠)混合，作用30 min后進(jìn)行SERS測定。激發(fā)光源為785 nm激光，掃描0～2000 cm范圍的拉曼光譜，分辨率為2 cm，積分時間10 s，累積3次。

圖1 紫檀芪對人血清白蛋白熒光光譜的影響Fig.1 Fluorescence quenching spectra of human serum albumin (HSA) in Pterostilbene (PTE)c(HSA)=1.0 μmol/L, c(PTE) (a-f): 0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 μmol/L; curve g: CHSA=0, CPTE=1.0 μmol/L; T=298 K, λex=280 nm

3 結(jié)果與討論

3.1熒光猝滅機(jī)制及猝滅常數(shù)

HSA的內(nèi)源性熒光主要來自于色氨酸(Try)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基。由于苯丙氨酸熒光量子產(chǎn)率(φ)為0.03～0.04，只有酪氨酸(φ=0.21)和色氨酸(φ=0.20)的1/10，而酪氨酸被電離或者接近羧基時其熒光幾乎全部猝滅，大多數(shù)情況下，可以認(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸的貢獻(xiàn)。不同濃度PTE對HSA熒光光譜影響見圖1，其中HSA在343 nm處有較強(qiáng)的熒光峰(曲線a)，而PTE較弱熒光(曲線g)不會對體系熒光強(qiáng)度的測量產(chǎn)生影響。隨著PTE濃度增加，HSA的熒光強(qiáng)度逐漸下降，峰形基本不變，但峰位略紅移4.1 nm(343.4 nm到347.5 nm)。由此推測，PTE與HSA兩者間發(fā)生了相互作用，可能形成了復(fù)合物。

在嚴(yán)格控制pH值和溫度的條件下，能使HSA熒光猝滅的原因有3種可能，即靜態(tài)猝滅、動態(tài)猝滅及非輻射共振能量轉(zhuǎn)移。其中，靜態(tài)猝滅是一種與復(fù)合物穩(wěn)定性有關(guān)的過程，溫度升高可降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，使猝滅常數(shù)Ksv減小; 而動態(tài)猝滅過程則依賴于擴(kuò)散過程，溫度升高將增加有效碰撞的離子數(shù)，并加快電子轉(zhuǎn)移過程，其猝滅常數(shù)Ksv隨溫度的升高而增大。

為了探討PTE對HSA的熒光猝滅機(jī)制，采用Stern-Volmer方程[14]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]處理數(shù)據(jù)。由于猝滅劑(PTE)濃度高過HSA濃度多倍，故可用猝滅劑加入初始濃度代替平衡濃度[Q]。以F0/F對[Q]作圖，Stern-Volmer擬合，由直線斜率獲得298、304和310 K時，PTE對HSA的猝滅常數(shù)Ksv和Kq值。由表1可知，Ksv值隨溫度升高而減小，說明PTE猝滅HSA熒光的機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅[8,14]。 此外，3個溫度條件下的Kq值均大于生物大分子的最大分散碰撞猝滅常數(shù)(2 × 1010L/(mol·s))[9]，這進(jìn)一步驗證PTE對HSA的熒光猝滅過程是由于兩者之間結(jié)合形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

圖2 HSA熒光發(fā)射光譜(a)與PTE吸收光譜(b)重疊圖Fig.2 Overlapping drawing of fluorescence spectrum of HSA (a) and absorbance spectrum of pterostilbene (b)CHSA=CPTE=1.0 μmol/L

表1 不同溫度下PTE對HSA的猝滅參數(shù)

Table 1 Quenching constants of interaction of PTE with HSA at different temperatures

T(K)Ksv(104L/mol)Kq(1012L/(mol·s))r2987．907．900．99833047．627．620．99843106．226．220．9974

3.2結(jié)合距離

根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，由HSA的熒光發(fā)射光譜和PTE的吸收光譜的重疊譜圖(見圖2)，采用矩形分割法可求得298 K時PTE與HSA濃度比為1∶1時的重疊積分J=2.008×10(cm3·L)/mol。對于HSA體系，φ=0.118，N=1.336，K2=2/3，可知R0=1.046 nm。而能量轉(zhuǎn)移效率E=0.105，求得r=1.495 nm。由于r<7 nm且0.5R0

3.3結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及作用力類型

對于靜態(tài)猝滅，若生物大分子中有n個相似且獨立的結(jié)合點位，則可應(yīng)用Lineweacer-Burk雙對數(shù)方程[15](lg[(F0-F)/F] =lgKA+nlg[Q])求得PTE與HSA的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點數(shù)n。以不同溫度下的lg[(F0-F)/F對lg[Q]作圖，其曲線的截距即為KA，而斜率即為n，相應(yīng)的計算結(jié)果列于表2。由曲線良好的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)(r>0.99)可以判斷，PTE與HSA之間只有1個鍵合位，這與計算所得到的結(jié)合位點數(shù)n≈ 1是一致的。另外，結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而增大，說明高溫有利于PTE-HSA復(fù)合物生成。結(jié)合常數(shù)數(shù)量級達(dá)104以上，表明PTE與HSA間的結(jié)合能力較強(qiáng)，在血漿中PTE能夠通過HSA運輸和儲存，PET可在體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮其藥理功效。

表2 PTE與HSA作用的結(jié)合常數(shù)(KA)、結(jié)合位點數(shù)(n)和熱力學(xué)參數(shù)

Table 2 Binding constants(KA), number of binding sites(n) and thermodynamic parameters for the interaction of PTE with HSA at different temperatures

T(K)KA(L/mol)nrΔH(kJ/mol)ΔG(kJ/mol)ΔS(J/(mol·K))2981．12×1040．840．9982197．23-22．87738．623044．07×1040．950．9989-27．313102．45×1051．120．9920-31．74

小分子與蛋白質(zhì)間作用力主要包括氫鍵、范德華力、靜電相互作用及疏水作用力四種非共價形式[16]。通?？梢愿鶕?jù)反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)焓變(ΔH)和熵變(ΔS)的大小及正負(fù)來大致確定作用力的類型，方程如下[8, 13]：

ΔG=RTlnKA=ΔH-TΔS

(1)

lnKA=ΔH/RT+ ΔS/R

(2)

圖3 PTE與HSA相互作用的Van't Hoff曲線Fig.3 Van't Hoff plot of interaction between HSA and PTE

式中，R為氣體常數(shù);KA為不同溫度下的結(jié)合常數(shù)。當(dāng)溫度變化不大時，反應(yīng)過程的ΔH可以視作常數(shù)。以不同溫度下的lnKA對1/T作圖3，由直線斜率和截距可以獲得PTE與HSA結(jié)合的ΔH和ΔS，結(jié)果見表2。ΔH和ΔS值均為正值，根據(jù)文獻(xiàn)[17]推斷PTE與HSA間主要作用力為疏水作用力。ΔG為負(fù)值，說明PTE與HSA作用過程為自由能降低的自發(fā)、吸熱(ΔH為正值)過程。

3.4結(jié)合位置

Sudlow等[18]研究發(fā)現(xiàn)，小分子配體在血清白蛋白上至少有3個特異的高親和藥物結(jié)合位點，即SiteⅠ、SiteⅡ和SiteⅢ。本研究以保泰松、布洛芬和洋地黃毒苷分別作為HSA的SiteⅠ、 SiteⅡ和SiteⅢ位點標(biāo)記物，進(jìn)行了位點競爭結(jié)合實驗， 通過考察PTE對標(biāo)記物-HSA復(fù)合物體系熒光性質(zhì)的影響，研究PTE分子在HSA上的結(jié)合位點。Sudlow等[18]提出標(biāo)記物取代百分?jǐn)?shù)的表達(dá)式：

(3)

式中，F(xiàn)2和F1分別為存在和不存在位點標(biāo)記物時的熒光強(qiáng)度。以取代百分?jǐn)?shù)對PTE濃度作圖，發(fā)現(xiàn)隨著PTE濃度逐漸增加，洋地黃毒苷-HSA二元體系熒光強(qiáng)度降低幅度較保泰松-HSA、布洛芬-HSA兩二元體系更顯著。表明PTE取代了洋地黃毒苷與HSA發(fā)生結(jié)合。另外，對3種位點標(biāo)記物-HSA二元體系加入PTE后的表觀結(jié)合常數(shù)KA′和結(jié)合常數(shù)的變化率φ(φ=(KA′-KA)/KA)進(jìn)行計算。由表3可知，與不存在標(biāo)記物的PTE-HSA體系相比，洋地黃毒苷的存在對于表觀結(jié)合常數(shù)的影響最大。這再次說明PTE在HSA上的結(jié)合位置主要是Site Ⅲ。

表3 位點標(biāo)記物對PTE與HSA相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)的影響

Table 3 Effect of site marker probes on binding constants of PTE-HSA systems

MarkerprobeBlankPhenylbutazoneIbuprofenDigitoxinKA′(L/mol)1．12×1049．29×1037．49×1035．48×103φ(%)—-17．05-33．13-51．07

3.5PTE對HSA構(gòu)象的影響

3.5.1同步熒光光譜同步熒光光譜能提供蛋白質(zhì)中氨基酸殘基周圍微環(huán)境變化信息，可用于研究藥物分子作用對HSA構(gòu)象的影響。Δλ= 60 nm同步熒光僅表現(xiàn)色氨酸殘基的光譜性質(zhì); 而Δλ= 15 nm同步熒光僅表現(xiàn)酪氨酸殘基的光譜性質(zhì)[9,19]。隨著PET濃度逐漸增加，HSA同步熒光強(qiáng)度均發(fā)生明顯猝滅(圖4)。其中，酪氨酸殘基的同步熒光峰位沒有發(fā)生位移，而色氨酸殘基同步熒光峰位紅移3 nm，表明PTE的加入使HSA的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的改變，令色氨酸殘基所處微環(huán)境極性增加。即HSA與PTE結(jié)合導(dǎo)致其內(nèi)部的疏水腔有所瓦解，結(jié)構(gòu)變得松散[14]。

圖4 PTE-HSA的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of PTE-HSA system(A) Δλ=15 nm, (B)Δλ=60 nm. CHSA=1.0 μmol/L, CPTE(a-f): 0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 μmol/L

3.5.2三維熒光光譜通常蛋白質(zhì)與藥物結(jié)合后，若其三維熒光光譜中出現(xiàn)熒光峰位置遷移、熒光峰消失或出現(xiàn)新的熒光峰，則可以推測蛋白質(zhì)的構(gòu)象、熒光團(tuán)微環(huán)境發(fā)生了改變。圖5為HSA(A)和PTE-HSA(B)體系的三維熒光等高圖。其中，“山脊”形狀的峰a為瑞利散射峰(λem=λex)，其強(qiáng)度隨PTE加入而降低，原因在于血清白蛋白表面結(jié)合PTE后，破壞了蛋白質(zhì)表面的保護(hù)水膜，使原來較為分散的蛋白質(zhì)更加分散，即發(fā)生所謂的解聚作用，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)粒徑減小，熒光強(qiáng)度減弱，這與同步熒光光譜的結(jié)果一致。另外，HSA具有的兩個典型熒光峰1(F=1329.8，λem=285 nm，λex=345 nm)和熒光峰2(F=150.0，λem=230 nm，λex=345 nm)，與PTE作用后其復(fù)合物的熒光峰1(F=727.0，λem=285 nm，λex=350 nm)和熒光峰2(F=84.0，λem=230 nm，λex=350nm)的熒光強(qiáng)度均發(fā)生了降低和熒光峰位置紅移5 nm現(xiàn)象，說明PTE的加入導(dǎo)致HSA色氨酸、酪氨酸殘基微環(huán)境及多肽骨架結(jié)構(gòu)(二級構(gòu)象)發(fā)生了變化。

圖5 HSA(A)和PTE-HSA(B)的三維熒光等高光譜Fig.5 Three-dimensional fluorescent contour spectra of (A) HSA and (B) PTE-HSA complex(A) CHSA=1.0 μmol/L, CPTE=0; (B) CHSA=1.0 μmol/L, CPTE=6.0 μmol/L

3.6化學(xué)鍵及對PTE構(gòu)象影響

由于PTE分子結(jié)構(gòu)，其溶液SERS特征峰振動模式歸屬對于分析PTE-HSA體系中兩者間結(jié)合狀態(tài)非常重要。基于此，文中首先利用密度泛函理論(DFT)獲得PTE分子構(gòu)象和DFT拉曼光譜信息。

3.6.1PTE的分子結(jié)構(gòu)應(yīng)用DFT的B3LYP方法在6-311++(d，p)[12, 20]水平上對PTE分子幾何構(gòu)型進(jìn)行優(yōu)化，獲得PTE理論拉曼光譜。優(yōu)化后的PTE分子結(jié)構(gòu)式如圖6所示，PTE分子中除酚羥基的H12′、兩個甲基的8個原子C16、H18、H19、H20、C17、H21、H22和H23在平面外，其它27個原子基本位于同一個平面上，無虛頻存在，說明優(yōu)化結(jié)構(gòu)是最穩(wěn)定的。

3.6.2PTE的理論拉曼光譜、NRS和SERS的振動模式指認(rèn)圖7為PTE理論拉曼光譜(曲線a)、固體粉末的NRS(曲線b)和其在生理pH值銀溶膠體系中的SERS(曲線c)。PTE的NRS和SERS峰位與理論計算拉曼光譜基本一致，其主要基團(tuán)的拉曼峰都存在，只是存在峰位稍有偏移或強(qiáng)度的變化。結(jié)合PTE理論拉曼光譜并參考文獻(xiàn)[15,21]，對PTE分子各振動峰進(jìn)行歸屬分析，結(jié)果表明，這些譜峰均不同程度由多個振動模式疊加而成，詳見表4。

PTE的SERS圖譜中，最明顯的增強(qiáng)模式位于1393和942 cm附近。其中，1393 cm譜峰對應(yīng)于A環(huán)和B環(huán)的14型伸縮振動和乙烯基連接H12、H13的面內(nèi)搖擺振動。表面選擇定則認(rèn)為[22]，垂直于增強(qiáng)基底表面的振動模式能夠被顯著增強(qiáng)，而平行于增強(qiáng)基底表面的振動模式增強(qiáng)較小。由此可知，PTE的A和B兩環(huán)及乙烯基連接的兩個H原子是垂直于銀納米粒子的表面。另外，942 cm

圖6 PTE的最優(yōu)結(jié)構(gòu)Fig.6 Optimal structure of PTE

譜峰對應(yīng)于B環(huán)的12型面內(nèi)變形振動和動和C3—O14—C16、C5—O15—C17伸縮振動， 該振動峰在NRS中是一個弱峰，但在SERS中是一個較強(qiáng)峰，這再次表明PTE分子以垂直方式結(jié)合于基底表面。而1628和1593 cm兩處苯環(huán)伸縮振動和

圖7 PTE理論拉曼光譜(a)、NRS(b)和SERS(c)的比較Fig.7 Comparison of colloid SERS (a), normal Raman spectrum (b), and DFT spectrum (c) of PTE in Raman shift region of 0-2000 cm1

表4 PTE的實測拉曼特征峰與理論計算值及其歸屬

Table 4 Band assignments for a calculated Raman, normal Raman and SERS spectra of pterostilbene adsorbed on silver colloid

Ramanshift(cm-1)DFTNRSSERSAssignment167716321628v(C7=C8)+v(C=C)8aA，B159315971593v(C=C)8aA+v(C7=C8)+v(C=C)8bB14981507—v(C=C)19aA+ρ(CH3)+v(C=C)19bB145114451445v(C=C)19bA+δ(CH3)140413541393v(C=C)14B+ρ(C7—H12，C8—H13)+v(C=C)14A132613151288v(C=C)14B+ρ(C7—H12，C8—H13)+v(C=C)14A118012041214δ(CCC)12A+v(C1—C7，C3—O14，O15—C17)112011721166v(C8—C1′)+δ(CCC)12B109111461025v(C4′—O11′)+ρ(O11′—H12′)+δ(CCC)1B1022985942v(O14—C16，O15—C17，C1—C7)981959918δ(CCC)12B+v(C3—O14—C16，C5—O15—C17)888862—v(C7—C1)+δ(CCC)6aA+v(C3—O14，C5—O15)831795829γ(C—H)11B+γ(H12—C7=C8—H13)774—791v(C4′—O11′)+δ(CCC)6aB+σ(C8=C7—C1)+v(C3—O14，C5—O15)ν：伸縮振動；δ：面內(nèi)彎曲振動；γ：面外彎曲振動；σ：剪切；ρ：搖擺．ν：Stretching；δ：in?planbending；γ：out?ofplanebending；σ：scissoring；ρ：wagging．

圖8 HSA (a)、PTE(b)和PTE-HSA(c)的SERS譜圖Fig.8 SERS of HSA(a), PTE(b) and PTE-HSA complex (c) on silver colloid substratea-c: HSA∶PTE=0∶1, 1∶0 and 1∶2

3.6.3PTE與HSA作用后的SERS所制備的銀溶膠對HSA拉曼振動峰的增強(qiáng)效果很小(圖8曲線a)。這是因為HSA為生物大分子，其空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大，導(dǎo)致HSA在不同增強(qiáng)基底上的SERS無論是振動峰位、強(qiáng)度，還是峰與峰的相對強(qiáng)度等方面有一定的差別[24]。制備的銀溶膠盡管對PTE分子的拉曼振動峰有增強(qiáng)作用(圖8曲線b)，但對HSA的增強(qiáng)效果卻很小。

PTE溶液的SERS中除了表4中列出的振動類型外，還包含乙醇溶劑分子的拉曼振動峰(866、1023和1083 cm)。PTE溶液與HSA作用后乙醇振動峰的強(qiáng)度明顯減弱，溶劑的存在對實驗結(jié)果分析影響不大。另外，PTE的SERS中還存在甲氧基伸縮振動峰(718 cm)，與HSA作用后，此振動峰紅移至725 cm，且相對強(qiáng)度降低，這說明PTE以甲氧基團(tuán)嵌入到HSA的疏水位點中。由能量最低就近原則可知，HSA與PTE進(jìn)行相互作用時，HSA首先與距離較近的甲氧基團(tuán)嵌合，但所需能量很低， 不會影響PTE分子的空間取向。PTE與HSA作用后， 1393 cm附近的振動峰減弱，這應(yīng)是受到與HSA非共價鍵結(jié)合甲氧基團(tuán)的干擾。而其它振動峰的相對強(qiáng)度和相對位移變化不明顯，且信噪比較差，這再次說明上述過程的發(fā)生。另外，與HSA作用前后的PTE的SERS中，始終都有伸縮振動峰223 cm的存在，表明PTE雖然以甲氧基團(tuán)與HSA進(jìn)行結(jié)合，但PTE與HSA作用后仍然通過與銀表面進(jìn)行吸附，該嵌合過程沒有影響PTE分子在銀納米粒子上的空間取向，吸附方式仍為傾斜吸附。

4 結(jié) 論

本研究采用熒光光譜結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜法，在模擬人體生理條件下，研究了PTE與HSA的相互作用。闡明PTE對HSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅并伴隨有非輻射能量轉(zhuǎn)移，推斷PTE分子以甲氧基通過疏水作用方式與HSA的SiteⅢ進(jìn)行結(jié)合，兩者間的結(jié)合作用較強(qiáng)，其結(jié)合常數(shù)為104數(shù)量級，結(jié)合位點數(shù)≈1，結(jié)合距離為1.495 nm。與PTE作用引起了HSA構(gòu)象發(fā)生變化，但PTE構(gòu)象沒有顯著影響。說明PTE以非共價方式與HSA結(jié)合，進(jìn)而被運輸、釋放、發(fā)揮藥理功效。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21153003).

StudyofIntermolecularInteractionsBetweenPterostilbeneandHumanSerumAlbuminbyFluorescenceSpectrometry-SurfaceEnhancedRamanSpectroscopy

SHEN Bing-Jun1, JIN Li-Hong*2, LIU Yu-Xin2, CHAI Hao2, LIU Zhan-Wei2, LIU Rong-Juan2, TIAN Jian*1
(LaboratoryofCleanEnergyTechnology1,SchoolofLifeScienceandTechnology2,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China)

The binding mechanism between pterostilbene (PTE) and human serum albumin (HSA) was investigated by fluorescence spectrometry and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) under simulated physiological conditions. The experiment result showed that the effect between PTE and HSA was a static fluorescence quenching with F?rster′s non-radioactive energy transformation, and PTE could bind HSA strongly with a 1∶1 molar ratio. The binding distances between PTE and HSA was 1.495 nm, and the binding constants (KA) between PTE and HSA were 1.12 × 104(298 K), 4.07 × 104(304 K) and 2.45 ×105L/mol (310 K). SERS revealed that PTE combined with HAS by methoxy group. Thermodynamic data indicated that the interaction between PTE and HSA was mainly hydrophobic interaction. Marker competition experiments pointed out that the primary binding site for PTE was located at site III in HSA. Three-dimensional, synchronous fluorescence spectrum and SERS showed that the conformation of HSA changed apparently with the addition of PTE, resulting in the tryptophan residue of HSA exposing to a less hydrophobic micro-environment. However, the conformation of PTE did not change apparently with the addition of HSA.

Pterostilbene; Human serum albumin; Fluorescence; Surface enhanced Raman spectroscopy; Conformation change

29 May 2017; accepted 19 July 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.170341