王春花 孫蕊 王志銳 巨韓芳 穆成 趙慧 謝彤

2011—2015年天津地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌感染趨勢(shì)及耐藥情況分析

王春花 孫蕊 王志銳 巨韓芳 穆成 趙慧 謝彤

為了解天津地區(qū)臨床分離的非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的感染趨勢(shì)及耐藥情況，收集2011年1月1日至2015年12月31日天津市結(jié)核病控制中心及15個(gè)區(qū)(縣)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(或定點(diǎn)醫(yī)院)及監(jiān)獄醫(yī)院送檢的新發(fā)痰菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者所獲得的全部菌株，采用硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)進(jìn)行菌種鑒定，對(duì)NTM菌株采用比例法進(jìn)行鏈霉素(Sm)、異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、氧氟沙星(Ofx)和卡那霉素(Km)等6種抗結(jié)核藥物的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)。結(jié)果顯示，分離得到的3972株分枝桿菌中結(jié)核分枝桿菌有3899株(98.16%)，NTM有73株(1.84%)。NTM的總耐藥率為98.63%(72/73)，INH、Sm、RFP、EMB、Ofx、Km耐藥率分別為94.52%(69/73)、80.82%(59/73)、56.16%(41/73)、64.38%(47/73)、58.90%(43/73)和73.97%(54/73)。分離的NTM對(duì)6種藥物全耐藥的有21株，耐5種藥物的有17株，耐5種和6種藥物的菌株占52.05%(38/73)。耐藥譜分析顯示，耐6種藥物的菌株最多，占28.77%(21/73)，其次為耐3種藥物[Sm+IN+Km；10.96%(8/73)]和耐5種藥物[Sm+INH+RFP+EMB+Km；9.59%(7/73)]，所有耐藥組合中均含有INH。對(duì)6種藥物耐藥情況進(jìn)行趨勢(shì)檢驗(yàn)顯示，EMB的耐藥率[2011—2015年：93.33%(14/15)～42.86%(9/21)]呈不斷降低的趨勢(shì)(χ2=13.32，P=0.001)，其他5種藥物耐藥率未見變化。

分枝桿菌，非典型性； 抗結(jié)核藥； 抗藥性，細(xì)菌

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria，NTM)是指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌。NTM廣泛存在于自然界中，為人類重要條件致病菌，人主要通過(guò)環(huán)境水、土壤和氣溶膠感染NTM而患病，極少數(shù)通過(guò)動(dòng)物傳播給人[1]。

近年來(lái)，有報(bào)道顯示NTM病疫情呈上升趨勢(shì)[2-5]，且人類免疫缺陷病毒感染的快速增長(zhǎng)和免疫抑制劑的大量應(yīng)用可能加劇NTM的流行。NTM病與結(jié)核病相比無(wú)特異臨床特征，致病菌種繁多且耐藥率高，需要采用多種抗生素聯(lián)合治療，療程長(zhǎng)并伴有不良反應(yīng)，逐漸引起臨床和科研人員的廣泛關(guān)注[6]。本研究對(duì)天津地區(qū)NTM感染狀況和對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥情況進(jìn)行了分析。

材料和方法

1.菌株來(lái)源：收集2011年1月1日至2015年12月31日天津市結(jié)核病控制中心及15個(gè)區(qū)(縣)(包括和平區(qū)、河西區(qū)、南開區(qū)、河?xùn)|區(qū)、河北區(qū)、紅橋區(qū)、東麗區(qū)、津南區(qū)、西青區(qū)、北辰區(qū)、濱海新區(qū)、武清區(qū)、寶坻區(qū)、薊縣、寧河縣、靜?？h)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)、定點(diǎn)醫(yī)院，以及監(jiān)獄醫(yī)院送檢的新發(fā)痰菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者所獲得的全部菌株，進(jìn)行傳代和藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)。菌型鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果剔除重復(fù)培養(yǎng)和污染菌株后共計(jì)3972株，其中結(jié)核分枝桿菌(MTB)3899株，NTM 73株。

2.試劑與儀器：(1)試劑：改良羅氏培養(yǎng)基(購(gòu)自天津金章有限公司)和含藥改良羅氏培養(yǎng)基(購(gòu)自珠海貝索有限公司)均由天津市結(jié)核病控制中心統(tǒng)一購(gòu)買發(fā)放，并進(jìn)行質(zhì)量控制。(2)儀器：離心機(jī)(型號(hào)：HITACHI CR-9162，BECKmAN CS-6R，日本日立公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：DNP-9162，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；接種環(huán)滅菌器(型號(hào)：XZHY-3，購(gòu)自北京新中弘業(yè)儀表有限公司)；振蕩器(型號(hào)：MS3，購(gòu)自德國(guó)IKA公司)；移液器(德國(guó)Eppendorf 公司)。

3.MTB培養(yǎng)：使用堿處理-中和離心沉淀法對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行前消化處理。外送檢驗(yàn)菌株傳代處理，待生長(zhǎng)狀態(tài)良好開展藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)操作按MTB培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[7]。

4.菌群鑒定：采用噻吩-2-羧酸肼(TCH，濃度5 μg/ml)和對(duì)硝基苯甲酸(PNB，濃度500 μg/ml)初步鑒別MTB、牛分枝桿菌和NTM。試驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)告參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行[7]。

5.藥敏試驗(yàn)：采用《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]推薦的比例法藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)藥物濃度分別為：Sm 4 μg/ml、INH 0.2 μg/ml、RFP 40 μg/ml、EMB 2 μg/ml、Ofx 2 μg/ml和Km 30 μg/ml。若耐藥百分比大于1%，判定為受試菌株耐藥。

6.質(zhì)量控制：依據(jù)《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[8]開展試驗(yàn)；每批藥敏試劑均使用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv進(jìn)行質(zhì)量控制，數(shù)據(jù)雙人錄入復(fù)核。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.分枝桿菌的分離鑒定：分離得到的3972株分枝桿菌中，MTB有3899株(98.16%)，NTM有73株(1.84%)。2011—2015年分離的NTM情況見表1，經(jīng)檢驗(yàn)不同年份間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.65，P=0.421)。

表1 2011—2015年天津地區(qū)分枝桿菌臨床分離株的組成情況

2.藥敏試驗(yàn)結(jié)果：73株NTM進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，耐異煙肼的有69株，耐藥率高達(dá)94.52%； 其次是耐鏈霉素及耐卡那霉素較高，耐藥率分別為80.82%和73.97%；而耐利福平菌株最少，為41株，耐藥率也達(dá)到56.16%。同期MTB的對(duì)每種藥物的耐藥率低于NTM，見表 2。

表2 2011—2015年天津地區(qū)6種抗結(jié)核藥物在NTM和MTB臨床分離株中的耐藥情況[耐藥株數(shù)(耐藥率，%)]

在73株NTM中對(duì)6種抗結(jié)核藥物全敏感菌株僅有1株，總耐藥率為98.63%(72/73)，耐1種藥的菌株為3株，而6種藥物全耐藥的有21株，耐5種藥物的有17株，耐5種和6種藥物的菌株占52.05%(38/73)。藥譜分析顯示，耐6種藥物的菌株最多，占28.77%，其次為耐3種藥物(Sm+INH+Km)，占10.96%，以及耐5種藥物(Sm+INH+RFP+EMB+Km)，占9.59%。除1株全敏感、1株單耐Ofx和2株單耐EMB外，所有耐藥組合中均含有INH(表3)。針對(duì)不同年度分離的NTM對(duì)6種藥物耐藥情況進(jìn)行趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)顯示，EMB耐藥率出現(xiàn)降低趨勢(shì)(χ2=13.32，P=0.001)，其他5種藥物耐藥率變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

討 論

NTM種類多且廣泛存在于環(huán)境中，在公共場(chǎng)所、醫(yī)院自來(lái)水等都可檢出NTM[9-11]。全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)NTM分離率1990年為4.9%，2000年為11.1%，2010年為22.9%，全國(guó)NTM疫情呈上升趨勢(shì)[12-14]。張娟等[15]發(fā)現(xiàn)，2008—2012年沈陽(yáng)地區(qū)分枝桿菌標(biāo)本中NTM分離率從0.93%上升到2.43%。余斐等[2]也發(fā)現(xiàn)，2009—2014年杭州地區(qū)NTM檢出率從11.9%上升到25.8%。但南京市胸科醫(yī)院調(diào)查2011—2013年該院NTM分離率，發(fā)現(xiàn)數(shù)值輕度上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。湖北省5個(gè)耐藥肺結(jié)核診治試點(diǎn)地區(qū)2006—2014年NTM感染率無(wú)明顯增高趨勢(shì)，且感染率低于全國(guó)平均水平，僅為2.21%，與本研究結(jié)果相近[17]。

表3 2011—2015年天津地區(qū)73株NTM臨床分離株的耐藥譜分析

表4 2011—2015年天津地區(qū)NTM臨床分離株對(duì)6種抗結(jié)核藥物的耐藥情況[耐藥株數(shù)(耐藥率，%)]

本研究發(fā)現(xiàn)，2011—2015年天津地區(qū)NTM感染率未見明顯上升趨勢(shì)，明顯低于全國(guó)平均水平[14]，同時(shí)也低于廣州胸科醫(yī)院(23.16%)[18]、南京胸科醫(yī)院(5.9%)[16]和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院(21.4%)[2]，而與沈陽(yáng)(1.87%)[15]和湖北(2.21%)[17]等地相近，表明NTM感染狀況可能與地域、氣候條件相關(guān)。天津地區(qū)5年中發(fā)現(xiàn)NTM感染率并沒有出現(xiàn)明顯增高趨勢(shì)，同國(guó)家結(jié)核病數(shù)據(jù)趨勢(shì)不一致[14]，除了地域這一決定性因素外，還可能與天津市HIV疫情并不高，免疫低下人群不突出，以及天津地區(qū)無(wú)大型礦產(chǎn)資源，塵肺、矽肺、慢性阻塞性肺病少見，結(jié)核病疫情低，基礎(chǔ)肺病患者少等原因有關(guān)。此外，南方城市報(bào)道結(jié)果多為胸科醫(yī)院數(shù)據(jù)，有可能其病例來(lái)源于區(qū)(縣)基層結(jié)核病防治所或定點(diǎn)醫(yī)院，因沒有菌種鑒定能力按照結(jié)核病治療，而由于NTM的天然耐藥性導(dǎo)致治療效果不佳，進(jìn)而到省市級(jí)結(jié)核病?？漆t(yī)院治療，這可能導(dǎo)致患者選擇性偏倚，進(jìn)一步使NTM分離率增加。也有報(bào)道認(rèn)為隨著NTM受到廣泛重視，檢出技術(shù)提高，使得更多NTM被從分枝桿菌中鑒定出來(lái)，這可能也是NTM疫情升高原因之一[3]。

本研究顯示，NTM對(duì)抗結(jié)核藥物具有高度原始耐受性，尤其是對(duì)INH和Sm耐藥率高。吳龍章等[18]對(duì)2009—2011年廣州市1819例NTM菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示4種一線藥物耐藥率為INH 96.15%、Sm 76.25%、EMB 70.42%，與本研究結(jié)果接近；RFP耐藥率為72.51%，略高于本研究結(jié)果。胡春梅等[16]對(duì)南京市胸科醫(yī)院2011—2013年臨床NTM分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，顯示4種一線抗結(jié)核藥物的耐藥率中INH為91.8%，Sm為86.8%，與本研究結(jié)果接近(94.52%、80.82%)；而RFP和EMB的耐藥率為90.0%和78.2%，高于本研究結(jié)果(56.16%、64.38%)。兩項(xiàng)研究均顯示NTM對(duì)一線抗結(jié)核藥物具有高度原始耐受性，與本研究一致。耐藥譜分析顯示分離的NTM耐5種和6種藥物菌株占52.06%，耐6種藥物的菌株最多，其次為耐3種藥物(Sm+INH+Km)和耐5種藥物(Sm+INH+RFP+EMB+Km)，且所有耐藥組合中均含有INH。耐藥情況經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EMB耐藥率隨時(shí)間降低，其他5種藥物耐藥率未見變化，這可能是由于各年度分離NTM數(shù)較少，也可能與分離NTM種類不同有關(guān)[19]。本研究不足之處在于未對(duì)NTM進(jìn)行菌種分析，今后需進(jìn)行進(jìn)一步菌種鑒定，以掌握天津地區(qū)NTM種類。

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Analysisofinfectiontendencyanddrugresistanceofnontuberculousmycobacteriaisolatedfrom2011to2015inTianjin

WANGChun-hua*,SUNRui,WANGZhi-rui,JUHan-fang,MUCheng,ZHAOHui,XEITong.

*SchoolofPublicHealth,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;TuberculosisReferenceLaboratoryofTianjinCenterforTuberculosisControl,Tianjin300041,China

Correspondingauthor:WANGChun-hua,Email:wchua1976@sina.com

The aim of this study was to analyze the infection tendency and drug resistance of nontuberculous mycobacteria (NTM) isolated from 2011 to 2015 in Tianjin. From January 1, 2011 to December 31, 2015, all the sputum culture-positive strains from new tuberculous (TB) patients in the Tianjin Center for Tuberculosis Control and the 15 TB control institutions in municipality and country (or designated hospitals) and the prison hospitals were collected. Para-nitro benzoic acid (PNB) and Thiophene-2-carboxylic acid hydrazide (TCH) were used to identify the species. Ratio drug sensitive test was used to analysis the drug resistant rate of the NTM stains. Six drugs were tested, including Streptomycin (Sm), isoniazid (INH), rifampicin (RFP), ethambutol (EMB), ofloxacin (Ofx), and kanamycin (Km). Results showed that in the 3972 isolated strains, there were 3899 (98.16%) strains of MTB and 73 (1.84%) strains of NTM. The overall resistance rate of NTM was 98.63% (72/73). The drug resistance rate of NTM to INH, Sm, RFP, EMB, Ofx, and Km were 94.52% (69/73), 80.82% (59/73), 56.16% (41/73), 64.38% (47/73), 58.90% (43/73), and 73.97% (54/73). There were 21 strains resistant to all of the six drugs, and 17 strains resistant to five drugs, accounting for 52.06% (38/73) in all NTM. Drug resistance spectrum analysis indicated that the most common drug-resistant strains were resistant to all of the six drugs (28.77% (21/73)), followed by Sm+IN+Km (10.96% (8/73)) and Sm+INH+RFP+EMB+Km (9.59% (7/73)). INH was included in all above drug-resistant combination. The rate of EMB resistance decreased from 93.33% (14/15) in 2011 to 42.86% (9/21) in 2015 (χ2=13.32,P=0.001), while the resistance rate of other five drugs were not significantly changed from 2011 to 2015.

Mycobacteria, atypical; Antitubercular agents; Drug-resistance, bacterial

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.11.020

300070 天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院[王春花(博士后研究)]；天津市結(jié)核病控制中心結(jié)核參比室(王春花、孫蕊、王志銳、巨韓芳、穆成、趙慧、謝彤)

王春花，Email：wchua1976@sina.com

2017-03-16)

(本文編輯：李敬文)