朱來華，朱 可，逄春華，朱詠梅，鄭小龍，王 群，鄧明俊，孫 濤，張曉文

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

免疫豬群口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體與免疫劑量的關(guān)系

朱來華，朱 可，逄春華，朱詠梅，鄭小龍，王 群，鄧明俊，孫 濤，張曉文

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

為了鑒別免疫豬群3ABC抗體陽性豬是免疫動(dòng)物受到病毒感染引起的，還是疫苗中殘留的非結(jié)構(gòu)蛋白引起的，通過檢測(cè)免疫動(dòng)物體內(nèi)的3ABC抗體和病毒感染情況，探討3ABC抗體的出現(xiàn)與免疫劑量的關(guān)系。選取60日齡保育豬20頭，分成A、B、C、D 4個(gè)組，分別注射豬口蹄疫O型滅活疫苗（OS/99株）1、2、4、6 mL/頭。每組豬分別在免疫前1 d以及免疫后3、7、14、30和60 d，采集血清和鼻咽拭子，使用口蹄疫 3ABC間接ELISA檢測(cè)試劑盒、口蹄疫多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒以及病毒分離試驗(yàn)，檢測(cè)3ABC抗體和病毒感染情況，發(fā)現(xiàn)保育豬在低劑量（1 mL/頭或2 mL/頭）免疫后沒有檢測(cè)到非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，而高劑量（4 mL/頭或6mL/頭）免疫后出現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率升高，而且出現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性的動(dòng)物中沒有檢出病毒感染或病毒核酸。檢測(cè)結(jié)果提示這些免疫豬群非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的形成與免疫劑量有關(guān)。

口蹄疫；非結(jié)構(gòu)蛋白；ELISA；RT-PCR

口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是哺乳動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病，對(duì)易感的偶蹄動(dòng)物具有嚴(yán)重的潛在經(jīng)濟(jì)危害，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物疫病。3ABC是口蹄疫病毒（FMDV）重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，只有病毒在感染動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制時(shí)，才產(chǎn)生，并誘導(dǎo)產(chǎn)生3ABC抗體[1]。一般認(rèn)為，純化滅活疫苗抗原在體內(nèi)不能復(fù)制，因此免疫動(dòng)物不會(huì)檢測(cè)到3ABC抗體。這是3ABC抗體檢測(cè)可鑒別感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物的理論基礎(chǔ)。但現(xiàn)有研究資料表明，除了感染動(dòng)物，免疫動(dòng)物亦可檢測(cè)到3ABC抗體，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。如何有效消除該類假陽性的出現(xiàn)，提高檢疫結(jié)果的科學(xué)性和合理性，是當(dāng)前FMD檢疫工作亟需解決的問題。

為了鑒別免疫豬群3ABC抗體陽性豬是免疫動(dòng)物受到病毒感染引起的，還是疫苗中殘留的非結(jié)構(gòu)蛋白引起的，本研究通過檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中是否存在3ABC抗體以及鼻咽部拭子是否存在感染性病毒或病毒核酸，探討3ABC抗體出現(xiàn)與免疫劑量的關(guān)系。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物來自于山東省青島市某集團(tuán)公司養(yǎng)殖場(chǎng)。選擇NS抗體陰性和FMDV核酸陰性的60日齡保育豬20頭。

1.2 試驗(yàn)試劑

豬口蹄疫 O型滅活疫苗（OS/99株），購(gòu)自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠；口蹄疫 3ABC間接ELISA 檢測(cè)試劑盒（2012032608），購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；口蹄疫多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2013082702），購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；RNA提取試劑盒（QIAGEN RNeasy Mini Kit，批號(hào)151042932）；BHK21細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2 研究方法

2.1 豬群免疫

將60日齡保育豬20頭分成A、B、C、D 4個(gè)組，分別注射豬口蹄疫 O型滅活疫苗（OS/99株）1、2、4、6 mL/頭。

2.2 樣品采集

2.2.1 血清樣品采集。每組豬分別在免疫前1 d以及免疫后3、7、14、30和60 d，采集5 mL/頭血液，并分離血清。

2.2.2 拭子樣品采集。對(duì)3ABC抗體陽性樣品所對(duì)應(yīng)的動(dòng)物采集鼻咽部拭子，共采集拭子22份。每頭采集1份棉拭子，放在含有抗菌素的PBS液（pH 7.0～7.4）采樣瓶?jī)?nèi)。抗生素選用含有青霉素（2 000 IU/mL）、鏈霉素（2 mg/mL）、慶大霉素（50 μg/mL）、制霉菌素（1 000 IU/mL）。

2.3 豬群非結(jié)構(gòu)蛋白抗體水平檢測(cè)

使用酶標(biāo)儀（infinite M200），按ELISA試劑盒說明書對(duì)豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)和判定。P＜20%為陰性，即沒有FMDV-NS 特異性抗體；P≥20%為陽性，即含有FMDV-NS 特異性抗體。

2.4 3ABC抗體陽性免疫豬感染性鑒定

2.4.1 RT-PCR檢測(cè)

2.4.1.1 病毒RNA提取。按RNA提取試劑盒說明書提取樣品RNA。

2.4.1.2 RT-PCR操作程序。每份總體積20 μL，含16.8 μL RT-PCR 反應(yīng)液、1.2 μL 酶混合液、2 μL模板RNA或陽性對(duì)照RNA。在PCR擴(kuò)增儀（eppendorf realplex 4）上進(jìn)行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃3 min；然后按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后 60 ℃ 延伸 3 min。

2.4.1.3 電泳。用TBE電泳緩沖液配制2%的瓊脂糖（含0.5 μg/mL EB）平板，將10 μLPCR產(chǎn)物混合2 μL上樣緩沖液，加入凝膠孔中，5 V/cm電泳約30 min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。在紫外凝膠成像儀（INFINITY-3026 WL/26M）紫外燈下觀察結(jié)果。

2.4.1.4 結(jié)果判定。陽性對(duì)照出現(xiàn)131 bp條帶，陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)時(shí)，試驗(yàn)成立。被檢樣品出現(xiàn)131 bp擴(kuò)增帶為FMDV陽性，否則為陰性。

2.4.2 病毒分離。將3ABC抗體陽性對(duì)應(yīng)的拭子樣品處理物，接種于制備好的BHK21單層傳代細(xì)胞，將細(xì)胞重置于37 ℃培養(yǎng)，觀察病變細(xì)胞。

3 結(jié)果

3.1 A組3ABC抗體水平（免疫劑量1 mL/頭）

免疫前后所有動(dòng)物均檢測(cè)不到非結(jié)構(gòu)蛋白抗體（表1）。

3.2 B組3ABC抗體水平（免疫劑量2 mL/頭）

免疫前所有動(dòng)物均檢測(cè)不到抗體，僅1頭在免疫后14 d出現(xiàn)低水平抗體。這可能是非特異性反應(yīng)（表2）。

表1 A組豬免疫前后血清樣品中3ABC抗體水平測(cè)試值（P）單位：%

表2 B組豬免疫前后血清樣品中3ABC抗體水平測(cè)試值（P）單位：%

3.3 C組3ABC抗體水平（免疫劑量4 mL/頭）

免疫前所有動(dòng)物均檢測(cè)不到非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。免疫后7 d出現(xiàn)抗體，14 d后有3頭豬出現(xiàn)低水平抗體，其中1頭在免疫后30 d和60 d還有抗體（表3）。

表3 C組豬免疫前后血清樣品中3ABC抗體水平測(cè)試值（P）單位：%

3.4 D組3ABC抗體水平（免疫劑量6 mL/頭）

免疫前所有動(dòng)物均檢測(cè)不到非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。免疫后3 d，2頭動(dòng)物出現(xiàn)低水平抗體，但7 d后開始上升，7～14 d達(dá)到頂峰，80%的動(dòng)物出現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，只有1頭動(dòng)物在整個(gè)試驗(yàn)期間都未出現(xiàn)抗體（表4）。

表4 D組豬免疫前后血清樣品中3ABC抗體水平測(cè)試值（P）單位：%

3.5 RT-PCR結(jié)果

除陽性對(duì)照在131 bp處出現(xiàn)清晰的條帶外，其余樣品都未出現(xiàn)（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3.6 病毒分離結(jié)果

將22份3ABC抗體陽性的鼻咽喉部拭子樣品接種BHK21后，37 ℃培養(yǎng)3 d，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變。

4 討論與結(jié)論

FMDV在復(fù)制過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。FMDV 感染動(dòng)物既能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體，也能產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體[2]。豬在FMDV 感染后2周就能檢測(cè)到3ABC抗體[3]。而疫苗免疫動(dòng)物只能與結(jié)構(gòu)蛋白和病毒感染相關(guān)抗原（Virus infection associated antigen，VIAA）反應(yīng)[4]。這就為應(yīng)用FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)分注射疫苗動(dòng)物和自然感染動(dòng)物打下了理論基礎(chǔ)。3ABC聚蛋白是一種前體蛋白，作為感染的標(biāo)志可信度較大。許多資料認(rèn)為檢測(cè) 3ABC 抗體是確診感染的主要指標(biāo)[5]。近年來，許多試驗(yàn)驗(yàn)證了3ABC作為感染指標(biāo)的可靠性。Bergmann等[6]用試驗(yàn)血清和田間血清，以3A、3B、2C、3D和3ABC作為診斷抗原，對(duì)3ABCELISA進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)價(jià)，并與電轉(zhuǎn)移免疫印跡試驗(yàn)（Electro-immuno transfer-blot，EITB）結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)以3A、3B、3D和 3ABC 為抗原檢出的結(jié)果與病毒分離和 EITB檢出的結(jié)果相一致，尤其是3ABC效果最好，認(rèn)為3ABC-ELISA是普查感染動(dòng)物血清的最好方法。3ABC-ELISA是診斷FMD最安全、便宜、行之有效的方法，適合于出入境動(dòng)物檢疫、活畜調(diào)運(yùn)檢疫和大規(guī)模疫情調(diào)查。另外，試驗(yàn)的敏感性和特異性使3ABC-ELISA成為在消滅和控制FMD的策略中很有價(jià)值的診斷工具[7-11]。

60日齡保育豬免疫前沒有檢測(cè)到非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。保育豬在低劑量（1 mL或2 mL/頭）免疫后沒有檢測(cè)到非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，而高劑量（4 mL或6 mL/頭）免疫后出現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率升高。這提示免疫豬群非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的形成與免疫劑量有關(guān)，具體關(guān)聯(lián)程度有待于進(jìn)一步探討和分析。分析其原因可能是在疫苗生產(chǎn)的病毒增殖過程中，不可避免產(chǎn)生了非結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致高劑量疫苗中殘存的非結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。另外，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)是否與疫苗的不同批次或生產(chǎn)廠商有關(guān)，也有待于進(jìn)一步研究。

3ABC作為FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白，只有在病毒復(fù)制時(shí)，才能產(chǎn)生。因此，免疫豬群出現(xiàn)的3ABC抗體是由于免疫動(dòng)物感染引起的，還是由于疫苗中其他非特異性非結(jié)構(gòu)蛋白的殘留引起的，仍有待研究。22份3ABC抗體陽性的拭子樣品，病毒分離、RT-PCR檢測(cè)均呈現(xiàn)陰性，可以排除病毒感染。因此，可以確認(rèn)3ABC抗體的產(chǎn)生是非感染性因素。

FMD是國(guó)家重點(diǎn)控制的重大動(dòng)物疫病。我國(guó)對(duì)其實(shí)行強(qiáng)制免疫。由于目前所用疫苗沒有純化工序，病毒培養(yǎng)細(xì)胞中存在非結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致免疫后機(jī)體同樣產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。因此，簡(jiǎn)單地調(diào)整免疫程序和免疫頻度，不能從根本上消除動(dòng)物機(jī)體非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的存在。建議加強(qiáng)疫苗的制備工藝研究和監(jiān)管，確保疫苗的純度。

隨著新疫情的出現(xiàn)，特別是對(duì)于O型尚在流行、亞洲I型或A型時(shí)有發(fā)生的地區(qū)來說，實(shí)施強(qiáng)制免疫，意味著必須同時(shí)免疫不同血清型的單型疫苗。免疫頻度提高會(huì)造成非結(jié)構(gòu)蛋白的累積，造成假陽性反應(yīng)。因此，建議加大科研支持力度，重點(diǎn)加強(qiáng)聯(lián)苗研究與開發(fā)，以降低臨床免疫頻度。

[1] 朱詠梅，朱來華，鄭小龍，等. 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2015，32（4）：51-52.

[2] SILBERSTEIN E，KAPLAN G，TABOGA O，et al .Foot-and-mouth disease virus infected but not vaccinated cattle develop antibodies against recombinant 3AB1 nonstructural protein[J]. Archives of virology，1997（142）：795-805.

[3] RODRIGUEZ A，DOPAZO J，SAIZ J C，et al.Immunogenicity of nonstructural proteins of foot and mouth disease virus：differences between infected and vaccinated swine [J]. Archives of virology，1994（136）：123-131.

[4] ALONSO A，GOMES I，BAHNEMANN H G. The induction of antibodies against VIAA in cattle vaccinated and revaccinated with inactivated foot and mouth disease vaccine[J].Bol cent panam fiebre aftosa，1998（54）：53-54.

[5] MALIRAT V，NEITZERT E，BERGMANN I E，et al . Detection of cattle exposed to foot and mouth disease virus by means of an indirect ELISA test using bioengineered nonstructural polyprotein 3ABC [J]. Veterinary quarterly，1998，20（2）：24-26.

[6] BERGMANN I E，MALIRAT E V，NEITZERT E，et al . Improvement of serodiagnostic strategy for foot and mouth disease virus surveillance in cattle under systematic vaccination：a combined system of an indirect ELISA-3ABC with an enzyme-linked immunoelectrotransfer blot[J]. Archives of virology，2000（145）：473-489.

[7] 曹軼梅，劉在新，盧曾軍，等. 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因 3ABC在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（1）：115-118.

[8] 祝秀梅，盧曾軍，胡永浩，等.檢測(cè)豬血清口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體ELISA方法的建立[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43（1）：33-37.

[9] 李樂，信愛國(guó)，廖得芳，等. 中和抗體滴度檢測(cè)口蹄疫疫苗效果的研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（3）：223-224.

[10] 金明蘭，金寧一，魯會(huì)軍，等. 口蹄疫重組雞痘病毒活載體疫苗在豚鼠、豬體內(nèi)的毒性、分布及抗體消長(zhǎng)規(guī)律[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，27（6）803-805.

[11] 李樂，苗海生，胡騎，等. 口蹄疫LPB-ELISA抗體滴度和中和抗體滴度符合性研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（10）：147-150.

（責(zé)任編輯：杜憲）

Relationship between Nonstructural Protein Antibody of Foot-and-Mouth Disease and Immune Dose in Immunized Swine Groups

Zhu Laihua，Zhu Ke，Pang Chunhua，Zhu Yongmei，Zheng Xiaolong，Wang Qun，Deng Mingjun，Sun Tao，Zhang Xiaowen
（Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266002）

In order to identify whether 3ABC antibody positive swine inmmunized by vaccination were caused by virus infection or residual nonstructural protein（NS）in vaccine，detection of 3ABC antibody and virus infection in immunized animals was carried out，and the relationship between the appearance of 3ABC antibody and the dose of immunity was explored. Four groups（A，B，C and D）of 20 piglets at 60-day-old were injected with the Footand-mouth disease type O inactivated vaccine（OS/99 strain）at doses of 1，2，4 and 6 mL/ head，respectively.Sera and nasopharyngeal swabs were collected 1 days prior to immunization，and 3，7，14，30 and 60 days after immunization. NS antibodies and virus infection were detected by 3ABC indirect ELISA Kit，multiplex RT-PCR detection kit for FMDV，and virus infection detection. It was found that nonstructural protein antibodies were not detected in piglets after immunization at low doses (1 or 2 mL/heads). Whereas the positive rate of NS antibodiy was increased after immunization at high doses (4 or 6 mL/head)，and no virus infection or viral nucleic acid was detected in the animals with positive NS antibody. It was suggested that NS antibodies in the immunized swine were associated with vaccine doses.

Foot-and-mouth disease（FMD）；nonstructural protein（NS）；ELISA；RT-PCR

S852.4

B

1005-944X（2017）11-0082-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.022

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFF0208600）