張 旻，王 姝，王 娜，景宏麗，徐立蒲，吳 紹

（1.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100176；2.北京市水產技術推廣站，北京 100176）

金魚造血器官壞死病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立

張 旻1，王 姝2，王 娜1，景宏麗1，徐立蒲2，吳 紹1

（1.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100176；2.北京市水產技術推廣站，北京 100176）

金魚造血器官壞死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）是一種可感染金魚等鯉科魚類，并可導致其死亡的皰疹病毒。為了快速檢測病原，本研究根據(jù)GFHNV的主要衣殼蛋白（Major captor protein，MCP）序列中的一段保守基因序列，設計引物和TaqMan探針，建立了GFHNV特異性的實時熒光定量PCR檢測方法；并利用PCR反應擴增出的MCP基因，制備了pUC-GFHNV重組質粒作為陽性對照。經試驗，該方法檢測限最低可達10個拷貝數(shù)的目的基因，而且與錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）、甲魚虹彩病毒（Softshell turtle iridovirus，STIV）、流行性造血器官壞死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis，EHNV）、斑點叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV）以及白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）等5種水生動物病毒無交叉反應。該方法具有簡便、快速、敏感、特異等優(yōu)點，為該病的診斷與病原檢測提供了一個重要手段。

魚類病毒??；金魚造血器官壞死病毒；主要衣殼蛋白；實時熒光定量PCR；TaqMan探針

金魚造血器官壞死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）是第 2個分離自鯉科魚類的皰疹病毒，為有囊膜的雙鏈DNA病毒。其基因組大小約290.3 kb，外形呈二十面體，直徑約120 nm[1]。國際病毒系統(tǒng)分類與命名委員會將其命名為鯉皰疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV 2），隸 屬于 皰疹病毒目（Herpesvirales）異皰疹病毒科（Alloherpesviridae）鯉皰疹病毒屬（Cyprinivirus）[2]。

GFHNV是金魚造血器官壞死?。℅oldfish haematopoietic necrosis，GFHN）的病原，可以感染金魚、異育銀鯽以及鯽魚的其它變種，最適發(fā)病水溫為15～25 ℃。該病一旦暴發(fā)，導致的死亡率可達80%以上[3]?；疾◆~臨床癥狀包括活動減弱，體表、下頜充血等。將病魚解剖后可見肝臟、脾臟和腎臟腫大，有出血點，嚴重時魚鰾中分布有大量出血點[4]。

目前，日本、美國、英國、澳大利亞等國家均有GFHNV流行[1，5]。近年來我國江蘇省也發(fā)現(xiàn)存在GFHNV[3]。為有效防控流行，建立切實有效的GFHNV檢測方法非常重要。目前，由于缺乏針對GFHNV的敏感細胞系和抗體，通常使用分子生物學方法來檢測。

本研究綜合前人的研究經驗，建立了一種GFHNV特異性實時熒光定量PCR檢測方法。該方法檢測限可達10個拷貝數(shù)的目的基因，且不與其它病毒，特別是同為皰疹病毒的錦鯉皰疹病毒（KHV）發(fā)生交叉反應，是一種比較實用的檢測方法?；谠摲椒?，研制了金魚造血器官壞死病毒檢測試劑盒，并獲國家發(fā)明專利（ZL201410773825.7）。

1 材料與方法

1.1 病毒DNA

GFHNV、 KHV、甲魚虹彩病毒（Softshell turtle iridovirus，STIV）、流行性造血器官壞死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis，EHNV）、斑點叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV）以及白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）等6種病毒DNA，由本實驗室保存。

1.2 引物和探針的設計

根 據(jù)GenBank中GFHNV全 基 因 序列（NC_019495.1），在病毒主要衣殼蛋白（Major captor protein，MCP） 基 因 保 守 區(qū) 內選擇一段158 bp的片段，使用DNAStar和Primer Primer 5.0軟件，設計并合成實時熒光定量 PCR 的特 異性 Taqman 探針：Probe（5′-FAM－TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAGT A M R A-3′） 和 1 對 引 物：F（5′-CAAACCCAGCACCGTCAG ATGGT-3′）和 R（5′- ATCCGGCACAGGTGGCGTGT-3′）；探針的5′端用羧基熒光素（Carboxyf l uorescein，F(xiàn)AM）標記，3′端用羧基四甲基羅丹明（Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA）標記。所有探針和引物均由上海生工有限公司合成、標記。

1.3 實時熒光定量PCR反應體系的建立與優(yōu)化

以GFHNV基因組為模板，設立25 μL的初始反應體系（表1）和反應條件。反應條件為：95 ℃3 min（1個循環(huán)）；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s（40個循環(huán)）。

表1 GFHNV熒光定量PCR檢測方法初始反應體系

1.3.1 退火溫度的優(yōu)化。將退火溫度分別設置為：65.0、64.5、63.3、61.4、58.9、57.1 和 55.0 ℃，進行熒光定量PCR實驗，選擇Ct值最低的退火溫度作為最終退火溫度。

1.3.2 反應體系中的Mg2+濃度優(yōu)化。將反應體系中Mg2+終濃度設置為1.5、2.5、3.5、4.5 mmol/mL，分別進行熒光定量PCR實驗，選擇Ct值最低的Mg2+濃度作為反應體系的最終Mg2+濃度。

1.4 標準品的制備

目的基因序列：

下劃線部分為引物序列，方框內部分為探針序列。

目的基因由上海生工有限公司合成，并連接入載體pUC57。

1.5 實時熒光定量PCR檢測方法標準曲線的制作及靈敏度檢測

將重組質粒pUC/GFHNV進行10倍系列稀釋，分別以 101、102、103、104、105、106、107、108拷貝數(shù)重組質粒標準品為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，以空質粒樣品為陰性對照。使用1.3節(jié)確立的反應體系和反應條件，用實時熒光定量PCR儀自帶軟件Bio-Rad iQ5 Optical System Software繪制標準曲線，以確定該檢測方法的靈敏度。

1.6 實時熒光定量PCR檢測方法的特異性試驗

為了檢查該方法與其它水生動物病毒之間是否存在交叉反應，分別以EHNV，STIV，WSSV，KHV，CCV DNA為模板，進行實時熒光定量PCR。體系及反應條件同1.5。

1.7 臨床樣品檢測

利用本研究建立的GFHNV實時熒光定量PCR檢測方法和通常使用的PCR方法，對從江蘇省和北京市采集的10尾鯽魚樣品進行檢測，并比對檢測結果。

2 結果與分析

2.1 反應體系和反應條件的優(yōu)化

2.1.1 退火溫度的優(yōu)化。使用Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀，將退火溫度設置為65.0、64.5、63.3、61.4、58.9、57.1和55.0 ℃，分別進行熒光定量PCR實驗。反應體系見1.3。結果如圖1所示：退火溫度為58.9 ℃時，Ct值最低，為24.15。因此，將該方法退火溫度設置為59 ℃。

圖1 GFHNV實時熒光定量PCR檢測方法退火溫度優(yōu)化

2.1.2 反應體系中的Mg2+濃度優(yōu)化。將反應體系中的Mg2+終濃度設置為1.5、2.5、3.5、4.5 mmol/mL，分別進行熒光定量PCR實驗，相應調整水的體積，使反應體系保持25 μL，退火溫度為59 ℃。結果如圖2所示：Mg2+終濃度為3.5 mmol/mL時，Ct值最小，為18.80。因此，將反應體系中的Mg2+終濃度設置為3.5 mmol/mL。最終反應體系見表2。反應條件為：95℃ 3 min（1個循環(huán)）；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s（40個循環(huán)）。

圖2 GFHNV實時熒光定量PCR檢測方法Mg2+濃度優(yōu)化

表2 GFHNV熒光定量PCR檢測方法優(yōu)化后反應體系

2.2 標準曲線制作及檢測限

將10倍系列梯度稀釋的標準品pUC-GFHNV溶液（101～108copies）作為絕對定量標準品，進行實時熒光定量PCR。用橫坐標表示每個反應的拷貝數(shù)的對數(shù)值，縱坐標表示Ct值，制作標準曲線。反應在101～108拷貝濃度范圍內有較好的線性關系，斜率為-2.173，相關系數(shù)為0.989，線形回歸方程為Y=-2.173X+31.281；最低10 copies的模板樣品有明顯熒光信號，Ct值為29左右（圖3）。因此，該定量方法最低可以定量檢測至101拷貝/反應的目的基因。

圖3 GFHNV實時定量PCR檢測限及標準曲線

2.3 檢測方法特異性試驗

以 GFHNV、EHNV、STIV、WSSV、KHV、CCV的DNA為模板，進行實時熒光定量PCR。體系及反應條件見2.1.2。結果顯示，僅GFHNV模板有很明顯的擴增曲線，其他模版均無明顯熒光信號（圖4）。結果表明，該方法與其它5種水生動物病毒無交叉反應。

圖4 實時熒光定量PCR反應特異性檢測結果

2.4 臨床樣品檢測

對采集自江蘇省和北京市的10尾疑似患病鯽魚，提取腎臟組織DNA。以組織DNA作為檢測樣品，以濃度為1×107copies/μL的重組質粒和去離子水作為陽性對照和陰性對照，分別進行實時熒光定量PCR檢測和PCR檢測。按照2.1.2中的標準進行實時熒光定量PCR，按照Waltzek等[7]建立的方法進行PCR，將目的基因大小設為366 bp。實時熒光定量PCR結果顯示，4號和8號樣品為陽性（圖5），Ct值分別為17.48和22.85，說明4號樣品包含的病毒量大于8號；PCR結果顯示，只有4號和8號樣品擴增出目的基因（圖6），4號樣品DNA條帶亮度大于8號，說明4號樣品的模板濃度大于8號。2種檢測方法的檢測結果相同，都是4號和8號樣品為陽性，其他8份樣品均為陰性。這說明本研究建立的GFHNV實時熒光定量PCR檢測方法效果等同于常規(guī)的PCR檢測方法，可用于GFHNV的實際檢測。

圖5 實時熒光定量PCR臨床檢測結果

圖6 PCR臨床檢測結果

3 討論

GFHNV作為一種魚類烈性病毒性傳染病病原，國內外一直力求建立準確、高效的檢測方法，用于該病的防控。當前，魚類病毒的主要檢測方法包括病原分離法、基于目的基因擴增的分子生物學檢測方法和基于抗原抗體特異性反應的免疫學檢測方法。由于一直沒有穩(wěn)定的，針對GFHNV敏感細胞系的推廣應用，無法使用病原分離法分離GFHNV。目前，針對GFHNV免疫學檢測方法的報道也較少。上海海洋大學制備了GFHNV VP72重組蛋白，并將其作為抗原，建立了檢測GFHNV抗體的Western blot檢測技術[6]。不過由于Western blot技術本身的實驗特征，該方法不適合用于出入境檢驗檢疫、國內疫病監(jiān)測等大批量樣品檢測。

目前，國內外報道的針對GFHNV的檢測方法主要為分子生物學檢測方法，包括PCR方法[7-8]、實時熒光定量PCR方法[9-12]和環(huán)介導等溫擴增法（LAMP）[13-14]等。其中，實時熒光定量PCR方法作為一種常用的經典分子生物學檢測方法，已在水生動物疫病診斷中得到了廣泛應用。本研究建立的GFHNV實時熒光定量PCR方法，通過擴增曲線和Ct值來判斷樣品陰/陽性，加樣后因PCR管全封閉，不需電泳，因此節(jié)約了制膠和電泳的時間，全程約需1.5 h，比普通PCR減少了0.5～1 h，更加高效；由于不需要開蓋電泳，也杜絕了LAMP方法產生的氣溶膠污染問題。雖然已有針對GFHNV的熒光定量PCR檢測方法的報道，但其檢測限為20～83個拷貝數(shù)的病毒核酸[9-12]。而本研究建立方法的檢測限可達10個拷貝數(shù)，且不與其它病毒，特別是同為皰疹病毒的KHV發(fā)生交叉反應，是一種更加靈敏的檢測方法。作為陽性參考物質使用的pUC-GFHNV重組質粒，易于保存且制備方便。不僅如此，基于該方法研制的金魚造血器官壞死病毒檢測試劑盒，已獲國家發(fā)明專利授權（ZL201410773825.7），可作為檢測試劑提供給各檢測實驗室用于該病毒的研究和監(jiān)控工作。

綜上所述，根據(jù)GFHNV MCP保守基因設計引物、探針，建立的針對GFHNV的實時熒光定量PCR檢測方法，最低可以檢測到10個拷貝數(shù)的目的基因。特異性試驗結果表明，該方法對EHNV、KHV等病毒的DNA無反應，具備良好的特異性。臨床試驗結果表明，該方法的準確性等同于通常的PCR方法，可以特異高效的檢測GFHNV，適用于對GFHNV的檢測和監(jiān)控。

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（責任編輯；朱迪國）

Development of Real-time PCR Assay for the Detection of Goldfish Haematopoietic necrosis Virus（GFHNV）

Zhang Min1，Wang Shu2，Wang Na1，Jing Hongli1，Xu Lipu2，Wu Shaoqiang1
（1. The Institute of Animal and Plant Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176；2. Beijing Fisheries Technical Extension Station，Beijing 100176）

Goldfish haematopoietic necrosis virus（GFHNV）is a pathogen causing high mortalities of goldfish，which belongs to Cyprinivirus. In order to establish a high efficient and reliable diagnostic method，a real-time PCR assay for detection of GFHNV was developed in this paper. The primers and TaqMan probes were designed according to the conserved regions of major capsid protein（MCP）gene of GFHNV. And the MCP gene was ligated into the pUC57 plasmid vector to prepare of recombinant plasmid pUC-T/GFHNV as positive control. The detection limit of this Realtime PCR assay was 10 copies of viral gene segment（in pUC-GFHNV），and there was no cross reaction with other 5 aquatic viruses，such as Koi herpesvirus（KHV），Softshell turtle iridovirus（STIV），Epizootic haematopoietic necrosis（EHNV），Channel catfish virus（CCV）and White spot syndrome virus（WSSV）. It's showed that this real-time PCR assay was sensitive and specific for detection of GFHNV and provided an important means for the diagnosis and pathogen detection of the disease.

fish viral diseases；Goldfish haematopoietic necrosis virus（GFHNV）；major capsid protein（MCP）；real-time PCR；TaqMan probes

S941.41+9

B

1005-944X（2017）11-0099-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.026

國家科技支撐計劃（2013BAD12B02）；北京市觀賞魚產業(yè)創(chuàng)新團隊（BAIC03-2017）

吳紹強