劉 暢 ，逄春華 ，劉 存 ，王 靜 ，劉 琪 ，梁 琳 ，袁維峰 ，錢愛東 ，崔尚金

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3. 農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)北京科學(xué)觀測實驗站，北京 100193；4. 青島機(jī)場出入境檢驗檢疫局，山東青島 266108）

CDV、CPV、CAV-2及CPIV多重PCR的建立及應(yīng)用

劉 暢1，2，3，逄春華4，劉 存2，3，王 靜2，3，劉 琪2，3，梁 琳2，3，袁維峰2，錢愛東1，崔尚金1，2，3

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3. 農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)北京科學(xué)觀測實驗站，北京 100193；4. 青島機(jī)場出入境檢驗檢疫局，山東青島 266108）

為建立一種快速檢測犬瘟熱病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、犬腺病毒Ⅱ型（CAV-2）和犬副流感病毒（CPIV）的多重PCR方法，參照GenBank中的相關(guān)病毒基因序列，分別設(shè)計了4對引物，用于特異性擴(kuò)增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和CPIV NP基因上的目的片段。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了同時擴(kuò)增CDV（410 bp）、CPV（253 bp）、CVA-2（655 bp）和CPIV（868 bp）的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法，對CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV和犬冠狀病毒（CCV）的DNA或cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該方法的特異性良好。利用建立的多重PCR方法與單一PCR方法進(jìn)行敏感性比較，發(fā)現(xiàn)兩者敏感性相差10倍，證明多重PCR方法敏感性良好。利用該方法對從北京市采集的30份犬病料樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CDV陽性率為63.33%（19/30）、CPV陽性率為33.33%（10/30）、CAV-2陽性率為6.66%（2/30）、CPIV陽性率為0（0/30）。檢測結(jié)果證明建立的多重PCR方法可用于臨床診斷。

多重PCR；犬瘟熱病毒；犬細(xì)小病毒；犬腺病毒Ⅱ型；犬副流感病毒

犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV），犬細(xì)小病毒（Canine prvovirus，CPV），犬腺病毒Ⅱ型（Canine adenovirus type-2，CAV-2）和犬副流感病毒（Canine parainf l uenza virus，CPIV）是引起犬類疾病的主要病原體。CDV是一種引起急性、惡性、高度接觸性傳染病病原體。其流行范圍廣，感染率高。在我國哈爾濱市，CDV陽性率高達(dá)50.67%[1-3]。CPV主要引起犬的急性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎。在我國黑龍江省，其陽性率高達(dá)47.26%[4-6]。CAV-2主要引起犬持續(xù)高溫、咳嗽等，傳染性強(qiáng)，可造成全群咳嗽，往往與CDV、CPIV等其他呼吸道疾病混合感染[7-9]。CPIV是犬傳染性呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原之一，常引起犬的呼吸道疾病[10-11]。4種病原體在我國的陽性率都很高，給養(yǎng)犬業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

CDV、CPV、CAV-2和CPIV在臨床上經(jīng)常出現(xiàn)混合感染。這給診斷造成了一定的困難。對于臨床上需要檢測多個病毒樣本，單一PCR技術(shù)每次只能診斷1個病例，較為耗時、耗力。因此，有必要建立一種快速鑒別診斷方法，便于及時采取治療和防控措施，從而減少4種疾病給養(yǎng)犬業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗建立的CDV、CPV、CAV-2及CPIV多重PCR診斷方法很好地解決了這個問題，為臨床樣品的快速鑒別診斷提供了幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株。CDV、CPV、CAV-2和CPIV，均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑。Trans 2K plus Marker、Random primer、質(zhì)粒小提試劑盒，購自全式金公司；10 mmol/LdNTP、M-MLV酶、RNA酶抑制劑、pMD18-T Vector，均購自TaKaRa公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，購自上海生工生物有限公司；DNA、RNA快速提取試劑盒和2× Taq PCR Mix，購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計。參照GenBank中登錄CDV、CPV、CAV-2和CPIV基因組序列，借助Primer 5.0軟件設(shè)計4對特異性引物，將其用于擴(kuò)增檢測CDV（登錄號KU552082.1）、CPV（登錄號A26575.1）、CAV-2（登錄號U77082.1）和CPIV（登錄號JQ743318.1）的目的片段。引物由北京華大公司合成（表1）。

表1 多重PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 CPV和CAV-2 DNA的提取。參照艾德萊公司病毒DNA快速提取試劑盒說明書，提取病毒DNA。

1.2.2 CDV和CPIV cDNA的制備。參照艾德萊公司病毒RNA快速提取試劑盒說明書，提取病毒RNA。通過反轉(zhuǎn)錄的方法，采用10 μL的體系制備 CDV 和 CPIV 的 cDNA：RNA 3.0 μL、RNase free H2O 2.0 μL、Random Primer 1.0 μL。上述體系70 ℃反應(yīng)10 min，迅速急凍2 min。在上述反應(yīng)體系中繼續(xù)添加如下試劑：5×RT buffer 2.0 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL、 M-MLV 0.5 μL、RNA 酶抑制劑0.25 μL、RNase free H2O 0.75 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：30 ℃ 10 min、40 ℃ 1 h、75 ℃ 15 min。將得到的cDNA直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增或-80 ℃保存。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)粒的構(gòu)建。對CPV和CAV-2的DNA，CPIV和CDV的cDNA進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min；CDV和 CPIV 50℃ / CAV-2 53℃ /CPV 55℃ 30 s；72 ℃CPV和CDV 30 s/CAV-2和CPIV 1 min，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反應(yīng)體系為：LA Taq 酶1μL、10×Buffer 2 μL、MgCl20.5 μL、dNTP Mix 1 μL、cDNA 3 μL/DNA 2 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR產(chǎn)物膠回收后，分別與pMD18-T Vector 16 ℃連接過夜，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；隨機(jī)挑取單個菌落，對菌液經(jīng)PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒，送北京華大公司測序，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板。

1.2.4 CDV、CPV、CAV-2和 CPIV多 重 PCR方法的建立及退火溫度的優(yōu)化。分別以重組質(zhì)粒pMD-CDV-H、pMD-CPV-VP2、pMD-CAV-2-E3和pMD-CPIV-NP為模板，利用溫度梯度PCR儀，設(shè)置退火溫度50～60 ℃，依次遞增1 ℃，進(jìn)行退火溫度優(yōu)化。將反應(yīng)采用的PCR擴(kuò)增為50 μL體系：2× Taq PCR Mix 25 μL，CDV、CPV、CAV-2和CPIV上下游引物各1 μL，重組質(zhì)粒pMDCDV-H、pMD-CPV-VP2、pMD-CAV-2-E3和pMDCPIV-NP各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min；50～60 ℃（依次遞增 1 ℃）30 s；72 ℃ 1 min；34 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.2.5 多重PCR方法的特異性試驗。以優(yōu)化的多重PCR方法，對CDV、CPV、CAV-2、CPIV和犬冠狀病毒（CCV）的DNA或cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，來檢測該方法的特異性。

1.2.6 多重PCR方法的敏感性試驗。用分光光度測定儀，測定重組質(zhì)粒pMD-CDV-H、pMD-CPVVP2、pMD-CAV-2-E3和pMD-CPIV-NP的濃度；將該濃度按照拷貝數(shù)公式換算成拷貝數(shù)。濃度分別為 3.53×1011、8.65×1010、9.19×1010和 1.64×1011copies/μL。用ddH2O將各重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，以每個稀釋度的質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行多重PCR敏感性檢測。

1.2.7 多重PCR與單一PCR對臨床樣本檢測的比較實驗。用建立的多重PCR的方法與單一PCR方法對臨床采集的30份病料進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)粒的構(gòu)建

對CPV和CAV-2的DNA，CPIV和CDV的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物膠回收后，分別與pMD18-T Vector 16 ℃連接過夜，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；隨機(jī)挑取單個菌落，將菌液經(jīng)PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒，送至北京華大公司測序，制備標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)粒（圖1）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)粒構(gòu)建

2.2 多重PCR檢測方法最佳退火溫度的確定

分別以重組質(zhì)粒pMD-CDV-H、pMD-CPVVP2、pMD-CAV-2-E3和pMD-CPIV-NP為模板，通過多重PCR方法，分別對CDV、CPV、CAV-2和CPIV目的基因進(jìn)行擴(kuò)增；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得868、655、410和253 bp的目的片段，發(fā)現(xiàn)與預(yù)期大小相符（圖2）。經(jīng)過退火溫度的優(yōu)化，最終選擇54 ℃為多重PCR方法的最佳退火溫度。

圖2 多重PCR退火溫度的優(yōu)化

2.3 多重PCR的特異性試驗

采用建立的多重PCR方法，對CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV 和 CCV的DNA或cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)只有CDV、CPV、CAV-2、CPIV 和 CDV+CPV+CAV-2+CPIV有特異性條帶，CCV未有擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明該方法具有良好的特異性（圖3）。

圖3 多重PCR的特異性檢測

2.4 多重PCR方法的敏感性試驗

將初始濃度分別為 3.53×109、8.65×109、9.19×109和 1.64×109copies/μL的重組質(zhì)粒 pMDCDV-H、pMD-CPV-VP2、pMD-CAV-2-E3和pMDCPIV-NP，用ddH2O將各重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，取每個稀釋度的重組質(zhì)粒模板進(jìn)行多重PCR和單一PCR檢測。結(jié)果表明：多重PCR方法可以檢測CDV、CPV、CAV-2和CPIV的最低拷貝數(shù)分別為3.53×106、8.65×106、9.19×106和1.64×106copies/μL，而單一PCR的最低拷貝數(shù)分別為 3.53×105、8.65×105、9.19×106和 1.64×105copies/μL（圖4）。結(jié)果表明多重PCR方法特異性良好。利用建立的多重PCR方法與單一PCR方法進(jìn)行了敏感性比較，發(fā)現(xiàn)兩者敏感性相差10倍，多重PCR方法敏感性良好。其中，多重PCR與單一PCR方法的CAV-2敏感性試驗結(jié)果一致。

2.5 多重PCR與單一PCR方法的初步應(yīng)用對比

圖4 多重和單一PCR方法的敏感性試驗

2017年4月于北京農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)院隨機(jī)收集了犬糞便30份，-80 ℃保存。取糞便加入PBS重旋，離心取上清，提取DNA和RNA。通過比較發(fā)現(xiàn)，CDV、CPV、CAV陽性率分別為63.3%（19/30）、33.33%（10/30）、6.66%（2/30），CDV 和 CPV混合感染陽性率為33.33%（10/30），CAV-2和CPV混合感染陽性率為3.33%（1/30），CPIV陽性率為0（0/30）。單一PCR檢測的CDV陽性率為66.67%（20/30），而CPV、CAV-2和CPIV的結(jié)果與多重PCR一致（表2）。

表2 多重PCR方法和單一PCR方法臨床樣品結(jié)果單位：%

3 討論

隨著人民生活水平的提高，犬已成為人們的精神伴侶，甚至扮演著更為重要的角色。但犬類的多種疾病危害著犬的健康，甚至有些疾病不表現(xiàn)明顯特征，就直接導(dǎo)致犬死亡，給犬的飼養(yǎng)和防控增加了難度[12]。目前，對于多種病毒混合感染病癥的準(zhǔn)確診斷比較困難，尤其是在臨床癥狀相似的情況下[13]。本研究建立的多重PCR方法能夠?qū)DV、CPV、CAV-2、CPIV單個或混合感染的臨床樣品進(jìn)行快速鑒別診斷。

建立多重PCR反應(yīng)的過程中，引物設(shè)計是擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。它決定著PCR擴(kuò)增的特異性、效率和保真度等[14-15]。本試驗所用4對引物在設(shè)計時分別選取了CDV的H基因序列、CPV的VP2基因序列、CAV-2的E3基因序列和CPIV的NP基因序列。擴(kuò)增的目的片段大小間隔合適。經(jīng)電泳結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，各擴(kuò)增片段位置明確、條帶清晰、便于區(qū)分[16-17]。

本試驗建立了對CDV、CPV、CAV-2、CPIV快速診斷的多重PCR方法。通過敏感性試驗、特異性試驗和對30份臨床樣品進(jìn)行檢測，對多重PCR方法進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)結(jié)果均良好。臨床樣本檢測中，多重PCR和單一PCR的CPV、CAV-2和CPIV檢測結(jié)果均一致。這表明建立的多重PCR方法可靠性很高。與單一PCR方法進(jìn)行多次擴(kuò)增相比，本試驗建立的多重 PCR方法不僅省時、省力，節(jié)約成本，而且可以同時快速進(jìn)行4個目的基因的特異性擴(kuò)增，為犬常見病毒性傳染病的快速鑒別診斷以及流行病學(xué)調(diào)查提供了方法。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment and Rudimentary Application of the Multiplex PCR（mPCR）to the Detection of CDV、CPV、CAV-2 and CPIV

Liu Chang1，2，3，Pang Chunhua4，Liu Cun2，3，Wang Jing2，3，Liu Qi2，3，Liang Lin2，3，Yuang Weifeng2，Qian Aidong1，Cui Shangjin1，2，3
（1. College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118；2. Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；3. Beijing Observation Station for Veterinary Drug and Veterinary Biotechnology，Ministry of Agriculture，Beijing 100193；4. Qingdao Airport Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266108）

In order to establish a multiple PCR method for rapid detection of CDV，CPV，CAV-2 and CPIV，according to the gene sequences in GenBank，four pairs of specific primers were designed for amplifying the four specific fragments of CDV H，CPV VP2，CAV-2 E3 and CPIV NP. By optimization of annealing temperature，a multiplex PCR assay of CDV H（410 bp），CPV VP2（253 bp），CAV-2 E3（655 bp）and CPIV NP（868 bp）was established for simultaneous detection of the four viruses. The DNA or cDNA template of CDV，CPV，CAV-2，CPIV，CDV+CPV+CAV-2+ CPIV and CCV were detected by multiplex PCR，and the results showed that the specificity was good. The multiplex PCR method and the single PCR method were compared with the sensitivity. The results of difference was ten times，and the sensitivity of the multiplex PCR was good. Thirty clinical samples of affected dogs from Beijing City were detected by the multiplex PCR，and the positive rate of CDV，CPV，CAV-2 and CPIV were 63.33%（19/30），33.33%（10/30），6.66%（2/30）and 0（0/30），respectively. The results indicated that the established PCR method could be used for clinical diagnosis.

multiplex PCR；Canine distemper virus；Canine parvovirus；Canine adenovirus type-2；Canine parainf l uenza virus

S852.65

A

1005-944X（2017）11-0089-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.024

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0501003、2017YFD0500905）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項目（ASTIPIAS-15）；基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2016ywf-yb-12）

崔尚金