廖潔丹 ， 劉 薇 ， 朱夢(mèng)嬌 , 趙明秋 ， 陳金頂

(1．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院 , 廣東 佛山 528231 ， 2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 , 廣東 廣州 510642 ，3．廣東永順生物制藥股份有限公司 , 廣東 廣州 511356)

豬乙型腦炎病毒GZ0409-31分離株E基因遺傳進(jìn)化分析

廖潔丹1，2， 劉 薇2，3， 朱夢(mèng)嬌2, 趙明秋2， 陳金頂2

(1．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院 , 廣東 佛山 528231 ， 2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 , 廣東 廣州 510642 ，3．廣東永順生物制藥股份有限公司 , 廣東 廣州 511356)

本研究采用RT-PCR方法對(duì)分離自貴州省發(fā)病豬睪丸組織中的流行性乙型腦炎病毒GZ0409-31株的E基因進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)E基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分子遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。結(jié)果表明，乙型腦炎病毒GZ0409-31毒株與基因Ⅲ型的乙腦病毒毒株屬同一分支，遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。

豬 ； 乙型腦炎病毒 ；E基因 ； 遺傳進(jìn)化分析

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)又稱流行性乙型腦炎，簡(jiǎn)稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一種嚴(yán)重威脅人獸健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)性急性傳染病[1-2]。JE具有明顯的季節(jié)性和一定的地理分布區(qū)域，多發(fā)生于蚊蟲較多的夏秋季節(jié)，屬于自然疫源性疾病。豬是JEV的重要儲(chǔ)存宿主和增殖宿主，是JE的主要傳染源。JEV主要引起母豬的繁殖障礙，致死率雖不高，但可引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎，也可引起公豬辜丸炎或不育。因此，JE仍是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。此外，豬群中的JEV經(jīng)蚊媒傳播可導(dǎo)致人群及動(dòng)物的感染，給公共衛(wèi)生安全帶來極大的威脅。

JEV屬于黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)成員。病毒基因組為單股、正鏈RNA，全長(zhǎng)約11 kb，裸露的病毒RNA具有感染性。含有一個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼1個(gè)全長(zhǎng)為3 432個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，成熟切割加工后可形成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(核衣殼蛋白C、膜蛋白PrM/M和囊膜糖蛋白E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)及兩個(gè)多肽切割片段[4]。Chen W R和印度學(xué)者Uchil分別利用C-PrM、E基因核苷酸序列進(jìn)行分型顯示，到目前為止，JEV在世界范圍內(nèi)存在5個(gè)基因型[5- 6]。以往的基因分型顯示，同一地區(qū)只有一種基因型的分布[7]，而最近幾年許多地區(qū)出現(xiàn)新的基因型，同一地區(qū)的基因型分布越來越混雜。國內(nèi)有許多學(xué)者在乙腦不同的流行區(qū)域分離毒株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，以了解目前自然界JEV的流行分布、分子進(jìn)化、毒力變異等情況。本研究對(duì)從貴州省發(fā)病豬睪丸組織中分離到的JEV GZ0409-31毒株的E基因進(jìn)行序列測(cè)定，分析該毒株同其他JEV毒株的親緣關(guān)系，從分子水平上研究JE毒株的變異情況。充分了解該毒株的分子進(jìn)化情況，對(duì)JEV的分子流行病學(xué)調(diào)查、病毒抗原性、病毒基因型、病毒變異及基因工程疫苗的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 毒株背景 2004年從貴州省發(fā)病豬的睪丸組織中分離到JEV GZ0409-31分離株，病毒在PK15細(xì)胞中傳代擴(kuò)增后置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2 病毒RNA提取及RT-PCR鑒定 參照TRIZol Reagent試劑說明書抽提JEV GZ0409-31分離株的總RNA。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)引物將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：42 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h。以反轉(zhuǎn)獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

E1：5＇-CGGAATTCACATGTTTAATTGTCTGGGAAT-3＇；

E2：5＇-CGGGATCCATATC AGCATGCACATTGGT-3＇

PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 變性30 s，59 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.3 基因克隆及序列測(cè)定 參照OMEGA公司的DNA凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A?Gel Extraction Kit 50)將PCR產(chǎn)物純化回收，克隆入pMD18-T載體，選取陽性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 GZ0409-31分離株E基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列分析 使用DNAStar軟件將JEV GZ0409-31分離株的E基因核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中不同地區(qū)、不同年代分離的各基因型JEV毒株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，分析它們之間的相似性。

1.5 GZ0409-31分離株E基因進(jìn)化關(guān)系分析 從GenBank中選擇JE流行的多個(gè)國家和地區(qū)的各基因型JEV毒株的E基因序列，另選1株墨累河谷腦炎病毒株(MVEV)作為外群，采用NJ(Neighbor Joining)法，以E基因核苷酸序列為基礎(chǔ)構(gòu)建GZ0409-31分離株E基因進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 GZ0409-31分離株E基因RT-PCR擴(kuò)增 從病毒液中提取GZ0409-31分離株RNA進(jìn)行E基因的RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果見圖1。由圖1可見，E基因擴(kuò)增出約1 500 bp大小的片段，與預(yù)期片段大小相符。

圖1 GZ0409-31分離株E基因RT- PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DNA Marker DL-5 000； 1：E基因片段； 2：空白對(duì)照

2.2 GZ0409-31分離株E基因序列測(cè)定與分析 將擴(kuò)增出的E基因片段克隆至pMD18-T載體，進(jìn)行菌落篩選培養(yǎng)及質(zhì)粒PCR鑒定，后經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，獲得其序列數(shù)據(jù)。應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)GZ0409-31分離株E基因核苷酸和氨基酸序列與GenBank的JEV參考毒株序列進(jìn)行相似性比較分析。結(jié)果表明，GZ0409-31分離株E基因與基因 Ⅲ 型參考毒株SA14、JE-84等相應(yīng)序列的核苷酸相似性在96.2%～99.2%之間；與基因Ⅰ 型參考毒株SC04-27、HN04-11等相應(yīng)序列的核苷酸相似性在87.9%～88.3%之間；與基因 Ⅱ 型參考毒株JKT5441、FU相應(yīng)序列的核苷酸相似性分別為88.7%、88.3%；與基因 Ⅳ 型參考毒株JKT9092的核苷酸相似性為86.8%；與基因Ⅴ 型參考毒株Muar相應(yīng)序列的核苷酸相似性為78.1%。其中，GZ0409-31分離株E基因序列與基因 Ⅲ 型的JE-84株相應(yīng)序列的核苷酸相似性最高，為99.2%，與基因Ⅴ 型參考毒株Muar的相似性最低，為78.1%。在氨基酸水平上，GZ0409-31分離株E基因推導(dǎo)的氨基酸序列與各參考毒株相應(yīng)序列的相似性均在90%以上，其中與強(qiáng)毒株SA14的氨基酸相似性高達(dá)99.8%，與減毒活疫苗株SA14-14-2株的氨基酸相似性為97.8%。

2.3 GZ0409-31分離株E基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析 選擇國內(nèi)外已發(fā)表的JEV不同分離毒株基因型作為參考毒株，同時(shí)選l株墨累谷腦炎病毒(MVEV)作為外群，利用DNAStar和MEGA4.0分析軟件對(duì)GZ0409-31分離株E基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，所有毒株在基因進(jìn)化上分為5大簇，GZ0409-31分離株與歸屬基因 Ⅲ型的SA14源病毒株(SA14、SA14-14-2)，國內(nèi)JEV分離株Beijing-1、p3、Ha-3以及國外分離株VN50、Je-84等同處一個(gè)大分支，遺傳關(guān)系較近。根據(jù)同源性及進(jìn)化樹上分支的可信度，我們可以判定GZ0409-31分離株屬于JEV基因 Ⅲ 型(圖2)。

圖2 GZ0409-31株E基因遺傳進(jìn)化樹

3 討論

本研究通過對(duì)GZ0409-31分離株E基因核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列與參考毒株序列進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)GZ0409-31分離株E基因與野毒株SA14相應(yīng)序列存在28個(gè)核苷酸、1個(gè)氨基酸不一致，與弱毒疫苗株SA14-14-2相應(yīng)序列存在37個(gè)核苷酸、11個(gè)氨基酸不一致。有研究表明，JEV強(qiáng)弱毒株間E蛋白氨基酸變化與該病毒毒力相關(guān)[8-11]，與減毒關(guān)系密切的有E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439等幾個(gè)位點(diǎn)，其中尤其是E138和E176位點(diǎn)在JEV的減毒過程起了重要作用，這兩個(gè)位點(diǎn)氨基酸突變可能改變了E蛋自對(duì)細(xì)胞受體的吸附性，或者引起該病毒對(duì)其他細(xì)胞不可穿透，這兩種機(jī)理導(dǎo)致病毒毒力減弱[12-14]。Ni等在對(duì)JEV減毒機(jī)理進(jìn)行研究時(shí)認(rèn)為，E138位的谷氨酸(E)替代為賴氨酸(K)后毒力明顯的降低[15-16]。本研究結(jié)果表明，GZ0409-31分離株與SA14野毒株的E蛋白氨基酸序列幾乎一致，只存在一個(gè)氨基酸不一致，其毒力關(guān)鍵位點(diǎn)E138和E176也沒有發(fā)生改變，因此推測(cè)兩毒株E蛋白在結(jié)構(gòu)、功能及生物學(xué)活性上也極為相似；而SA14-14-2弱毒株的E基因在毒力關(guān)鍵位點(diǎn)E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439等都發(fā)生改變。由此可見，GZ0409-31分離株與疫苗株相比其毒力較強(qiáng)，親緣關(guān)系更接近SA14野毒株。

JEV遺傳進(jìn)化分析主要以Chen等[5]建立的依據(jù) prM 基因的240個(gè)核苷酸和 Paranjpe等[17]依據(jù)E基因全序列進(jìn)行JEV 基因分型。由于prM 基因的240個(gè)核苷酸序列較短，分析結(jié)果存在一定程度的可變性，而E蛋白基因被認(rèn)為具有良好的代表性，常用作JEV遺傳進(jìn)化分析的主要方法[18]。Wang等[19]對(duì)中國1949-2005年間10個(gè)省、市的JEV分離株的研究顯示，中國以基因 Ⅲ 型為主，兼有基因Ⅰ型。其中基因Ⅰ型的毒株最早分離來自1977年的云南省，隨后河南、廣西、遼寧、上海、四川的分離株也存在基因Ⅰ型；基因 Ⅲ 型分離株多來自黑龍江、北京、陜西、貴州、福建；遼寧、云南、上海、四川為基因Ⅰ型和基因 Ⅲ 型共存。另外，相同省份在不同的年份流行株的基因型也有不一致，例如上海在2001、2003、2005年分離到的流行株均為基因Ⅰ型，而2004年主要為基因 Ⅲ 型。2006年河南省南陽市的流行株全部屬于基因Ⅰ型，而河南省2004年的流行株也均屬于基因Ⅰ型[20]。本研究選擇國內(nèi)外已發(fā)表的JEV不同分離株為參考毒株，同時(shí)選l株墨累谷腦炎病毒(MVEV)作為外群，利用DNAStar和MEGA4.0分析軟件分別以GZ0409-31分離株E基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，GZ0409-31分離株與SA14源病毒株(SA14、SA14-14-2等) 基因 Ⅲ型的、國內(nèi)JEV分離株Beijing-1、p3、Ha-3以及國外分離株VN-50、01VN88等同處一個(gè)大分支，遺傳關(guān)系較近。綜上所述，GZ0409-31分離株E基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與JEV基因 Ⅲ型相應(yīng)序列相似性最高，由此表明，GZ0409-31分離株屬于JEV基因 Ⅲ型。

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GeneticEvolutionofEgeneofSwineJapaneseEncephalitisVirusGZ0409-31Strain

LIAO Jie-dan1,2， LIU Wei2,3， ZHU Meng-jiao2， ZHAO Ming-qiu2， CHEN Jin-ding2

(1.College of Life Science and Engineering，F(xiàn)oShan University, Foshan 528231, China;2.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;3. Guangdong Winsun Bio-pharmaceutical co., Itd，Guangzhou 511356, China)

In this study, theEgene ofJapaneseencephalitisvirusGZ0409-31 strain isolated from testicular tissue of Guizhou Province was cloned and sequenced by RT-PCR. The molecular genetic evolution ofEgene nucleotide sequence and deduced amino acid sequence was analyzed by bioinformatics software. The results showed that theJapaneseencephalitisvirusGZ0409-31 strain was the same genotype as the genotype Ⅲ of the Japanese encephalitis virus, and the genetic evolution was similar.

Swine;Encephalitisvirus;Egene; Genetic evolution analysis

CHEN Jin-ding

S855.3

A

0529-6005(2017)09-0003-04

2017-07-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0500600,2017YFD050114);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015B020230009，2015A050502044)

廖潔丹(1979-)，女，講師，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)，E-mail：liaojiedan@163.com

劉薇(1988-)，女，碩士,研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)，E-mail:liunei_10000@163.com

注：劉薇與廖潔丹對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

陳金頂，E-mail：jdchen@sacu.edu.cn