楊玉雪，張 璐，王瑩瑩，周厚琴，陸小華，魏士長，趙艷玲#(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137； .解放軍第30醫(yī)院藥學部，北京 100039)

*碩士。研究方向：中藥學。E-mail：diotimay@126.com

#通信作者：主任藥師，博士，研究員。研究方向：中藥藥理學。E-mail：zhaoyl2855@126.com

基于網(wǎng)絡藥理學預測三草顆粒治療自身免疫性肝炎的作用機制Δ

楊玉雪1,2*，張 璐1,2，王瑩瑩1,2，周厚琴1,2，陸小華1,2，魏士長2，趙艷玲2#
(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137； 2.解放軍第302醫(yī)院藥學部，北京 100039)

目的：基于網(wǎng)絡藥理學，初步探討三草顆粒治療自身免疫性肝炎的作用機制。方法：通過建立三草顆粒藥物靶點數(shù)據(jù)集、自身免疫性肝炎疾病靶點數(shù)據(jù)集，構建三草顆粒治療自身免疫性肝炎的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡，并通過可視化分析、網(wǎng)絡中各節(jié)點的拓撲參數(shù)分析，預測三草顆粒治療自身免疫性肝炎的作用機制。結果：網(wǎng)絡藥理學分析結果顯示，三草顆粒通過直接作用于雄激素受體、酪氨酸蛋白激酶、半胱氨酸蛋白酶-3、白細胞介素2、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶 K、雌激素受體、轉化生長因子β-2、WAS蛋白、信號轉導及轉錄激活因子等蛋白靶點，并通過調(diào)節(jié)自然殺傷細胞介導的細胞毒作用和T細胞受體信號通路和核轉錄因子kappa B信號通路等多通路，從而發(fā)揮治療自身免疫性肝炎的作用。結論：三草顆粒主要通過干預機體炎癥反應、調(diào)節(jié)機體免疫等治療自身免疫性肝炎。

網(wǎng)絡藥理學； 三草顆粒； 自身免疫性肝炎； 作用機制預測

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一種病因不明，與遺傳、環(huán)境因素和感染相關，機體耐受性減退，不能正確識別自身肝組織成分而產(chǎn)生的肝實質進行性損傷的自身免疫反應[1]，表現(xiàn)為以肝臟門靜脈周圍病變?yōu)橹鞯穆匝装Y病變，同時外周血中常存在各種自身抗體及高球蛋白血癥[2]。目前，對于AIH的治療尚缺乏特效藥物，常規(guī)使用的西藥主要為免疫抑制劑(如激素、硫唑嘌呤)，雖可起到暫時抑制異常免疫反應的作用，但長期使用會導致一系列異常，如嚴重的糖尿病、高血壓病和骨質疏松癥等，且不少文獻報道，長期使用免疫抑制劑與惡性腫瘤的發(fā)生有一定關聯(lián)[1]。三草顆粒源于解放軍第302醫(yī)院(以下簡稱“我院”)臨床長期應用的經(jīng)驗方“愈肝方”，由茜草、豨薟草、秦艽、丹參、連翹及甘草等6味藥材組成，具有清熱解毒、疏肝利膽、活血化瘀的功效。該方為我院臨床治療AIH的首選方藥，已應用十余年，臨床療效突出、不良反應小，可顯著延緩病情發(fā)展進程。本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學方法，探討三草顆粒治療AIH的作用機制，進一步分析其作為AIH治療用藥的合理性及針對性，以期為后續(xù)實驗研究及為臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1三草顆粒藥物靶點篩選

通過中草藥綜合數(shù)據(jù)庫(TDT，http://tcm.cmu.edu.tw/)[3]獲得三草顆粒所含的化學成分結構，再依據(jù)相似性比對中草藥活性成分數(shù)據(jù)庫(HIT，http://lifecenter.sgst.cn/hit/)[4]和治療靶點數(shù)據(jù)庫(TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)[5]進行靶點篩選，建立三草顆粒中藥物靶點數(shù)據(jù)集。

1.2AIH疾病靶點篩選

通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM，http://www.omim.org/)[6-7]篩選AIH疾病靶點，建立AIH靶點數(shù)據(jù)集。以上人類的靶點連接蛋白通過交互蛋白數(shù)據(jù)庫(http://dip.doe-mbi.ucla.edu)獲得。

1.3“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡的建立與分析

為進一步闡明三草顆粒中被鑒定的活性成分與AIH肝炎靶點之間的關系，將化學成分、成分靶點、AIH靶點和交互蛋白靶點連接成“化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡。將以上網(wǎng)絡導入Cytoscape 2.8.3軟件進行可視化分析，并分析各靶點的相關參數(shù)。以中介中心性、點度中心性和接近中心性3個拓撲參數(shù)為篩選有效作用靶點的依據(jù)。點度中心性≥2倍中位數(shù)、中介中心性和接近中心性≥1倍中位數(shù)的靶點為本研究得到的重要靶點[8]。

1.4京都基因與基因組百科全書(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)通路注釋分析

將“1.3”項下所得直接作用靶點的UniProt數(shù)據(jù)庫識別碼導入功能注釋工具DAVID中進行KEGG通路注釋分析，得出交互網(wǎng)絡中的直接作用靶點相關通路。

2 結果

2.1藥物靶點和疾病靶點數(shù)據(jù)的篩選結果

基于數(shù)據(jù)庫構建方法，共篩選出三草顆粒中68個化學成分和387個靶點蛋白。三草顆粒組方各藥物中，茜草化學成分16個，靶點51個；豨薟草化學成分24個，靶點75個；秦艽化學成分2個，靶點3個；丹參化學成分4個，靶點82個；連翹化學成分11個，靶點108個；甘草化學成分11個，靶點68個。共篩選出93個AIH相關蛋白靶點及514個交互蛋白靶點。

2.2“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建與分析

通過構建三草顆粒治療AIH的蛋白靶點的網(wǎng)絡，進一步深入理解其活性成分及作用機制，并得到更為詳實的信息。三草顆粒治療AIH的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡見圖1—2，其中，三草顆粒中被預測出的活性化合物以三角形標示；三草顆粒直接作用靶點以菱形標示；AIH疾病直接作用靶點以六邊形標示；藥物與疾病都作用的靶點以方形標示，其也是三草顆粒治療AIH最為重要的靶點蛋白；連接藥物與疾病靶點的交互蛋白以紫色圓點標示。經(jīng)分析，共篩選出12個三草顆粒對AIH的直接作用靶點，見表1。通過評估網(wǎng)絡中所有靶點的3個拓撲參數(shù)值，得出點度中心性的中位數(shù)值為2，接近中心性的中位數(shù)值為0.237，中介中心性的中位數(shù)值為0。表1中所列直接作用靶點雄激素受體、酪氨酸蛋白激酶Lck、酪氨酸蛋白激酶 Btk、半胱氨酸蛋白酶-3、白細胞介素2、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶 K、雌激素受體、轉化生長因子β-2、酪氨酸蛋白激酶ZAP-70、WAS蛋白、信號轉導及轉錄激活因子等，均滿足篩選條件，故認為這12個蛋白是三草顆粒治療AIH的重要蛋白。

圖1 三草顆粒治療AIH的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡圖Fig 1 “Ingredients-target-disease” interactive network of Sancao granules in treatment of autoimmune hepatitis

圖2 三草顆粒治療AIH的“成分-靶點-疾病”直接作用交互網(wǎng)絡圖Fig 2 “Ingredients-target-disease” interactive network of direct effects of Sancao granules in treatment of autoimmune hepatitis

表1 三草顆粒治療AIH的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡中直接作用靶點的拓撲參數(shù)分析Tab 1 Topological parameter analysis of “ingredients-target-disease” interactive network of direct effects of Sancao granules in treatment of autoimmune hepatitis

2.3KEGG通路分析

采用KEGG通路注釋分析，得出三草顆粒治療AIH直接作用靶點相關的通路共14條，分別為“Colorectal cancer”“Pancreatic cancer”“Primary immunodeficiency”“Inflammatory bowel disease(IBD)”“NF-kappa B signaling pathway”“T cell receptor signaling pathway”“Toxoplasmosis”“Natural killer cell mediated cytotoxicity”“Hepatitis B”“Tuberculosis”“Proteoglycans in cancer”“HTLV-I infection”“Pathways in cancer”和“Osteoclast differentiation”[“結直腸癌”“胰腺癌”“原發(fā)性免疫缺陷”“炎癥性腸病(IBD)”“核轉錄因子kappa B信號通路”“T細胞受體信號通路”“弓形蟲病”“自然殺傷細胞介導的細胞毒性作用”“乙型肝炎”“肺結核”“惡性腫瘤的蛋白聚糖”“人類親T細胞病毒Ⅰ感染”“惡性腫瘤通路”和“破骨細胞分化”]，均表現(xiàn)為直接或間接的免疫和炎癥相關，見圖3。其中，核轉錄因子kappa B是細胞內(nèi)中藥的轉錄調(diào)節(jié)因子，在維持機體的正常生理功能中起著重要作用。

圖3 三草顆粒治療AIH直接作用靶點的通路分析Fig 3 Pathway analysis of direct target of Sancao granules in treatment of autoimmune hepatitis

3 討論

AIH是一種進展性的慢性肝病，是異常的自身免疫反應介導的肝臟實質炎癥[9]，臨床表現(xiàn)以血清氨基轉移酶異常升高、高丙種球蛋白血癥和血清自身抗體陽性或伴有波動性黃疸為主，組織病理學檢查主要表現(xiàn)為匯管區(qū)大量漿細胞并向周圍肝實質浸潤形成界板炎癥[2]。AIH罕見自然緩解，不進行有效治療，可逐漸發(fā)展為肝硬化，最終致肝臟失代償、肝衰竭甚至死亡。目前，AIH的治療原則為改善癥狀、緩解生化指標異常、減輕肝臟炎癥和抑制肝組織纖維化進展。相關指南及大量臨床研究結果顯示，免疫抑制劑(單用潑尼松龍或潑尼松龍聯(lián)合硫唑嘌呤)是治療AIH的首選藥物，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，20%～40%患者的免疫抑制治療無效，長期服藥需警惕骨髓抑制、骨質疏松癥、增加并發(fā)腫瘤和感染等風險，且長期服藥患者停藥后會出現(xiàn)復發(fā)現(xiàn)象[10]。

中藥以其多成分、多靶點的特點在疾病治療中具有獨特的優(yōu)勢，可兼顧整體的調(diào)節(jié)。三草顆粒源于我國著名肝病專家汪承柏教授使用茜草、秦艽等中藥治療AIH的長期臨床實踐與經(jīng)驗總結，進而形成的專治AIH的院內(nèi)協(xié)定處方。該方既能改善臨床癥狀、恢復肝功能和改善纖維化程度，又具有調(diào)節(jié)機體免疫功能等方面的效果。本研究以AIH為疾病模型，初步探索了三草顆粒治療AIH的作用靶點及機制。結果顯示，雄激素受體、酪氨酸蛋白激酶Lck、酪氨酸蛋白激酶 Btk、半胱氨酸蛋白酶-3、白細胞介素2、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶 K、雌激素受體、轉化生長因子β-2、酪氨酸蛋白激酶ZAP-70、WAS蛋白、信號轉導和轉錄激活因子1-α/β為三草顆粒治療AIH的直接作用靶點。其中，蛋白酪氨酸激酶是一類催化ATP上γ-磷酸轉移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白質酪氨酸殘基磷酸化，在細胞生長、增殖、分化中具有重要作用。白細胞介素2是一種激活T細胞，維持T細胞增殖、活化，同時也參與炎癥和自身免疫反應的T細胞生長因子。近年來研究結果顯示，白細胞介素2可維持Treg細胞的穩(wěn)定及其介導的免疫耐受，具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用[11]。信號轉導和轉錄激活因子是一類由細胞因子、生長因子等多肽類配體激活的轉錄因子，可調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡[12]。

大量研究結果顯示，AIH的免疫病理損傷機制主要涉及細胞介導的細胞毒作用和細胞介導的、抗體依賴的細胞毒作用等2個方面。本研究進行通路注釋分析，結果顯示，三草顆?？赏ㄟ^自然殺傷細胞介導的細胞毒作用和T細胞受體信號通路發(fā)揮治療AIH的作用。同時，炎癥通路核轉錄因子kappa B信號通路也發(fā)揮著重要作用。

綜合以上分析，三草顆粒治療AIH的機制主要與干預機體炎癥反應和調(diào)節(jié)機體免疫有關。本研究體現(xiàn)了網(wǎng)絡藥理學在臨床疾病輔助治療藥物的研發(fā)方面所起到的創(chuàng)新性作用，但屬于計算機模擬研究，得出的結論仍有一定的不確定性，故本研究需建立在文獻調(diào)研之上及后續(xù)進一步實驗驗證。

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PredictionofMechanismofSancaoGranulesinTreatmentofAutoimmuneHepatitisBasedonNetworkPharmacologyΔ

YANG Yuxue1,2, ZHANG Lu1,2, WANG Yingying1,2, ZHOU Houqin1,2, LU Xiaohua1,2, WEI Shizhang2, ZHAO Yanling2
(1.College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137, China; 2.Dept.of Pharmacy, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China)

OBJECTIVE: To preliminarily probe into Sancao granules in treatment of autoimmune hepatitis based on network pharmacology. METHODS: Through establishment of target data of Sancao granules and autoimmune hepatitis, development of “ingredients-target-disease” interactive network of Sancao granules in treatment of autoimmune hepatitis, the mechanism of Sancao granules in treatment of autoimmune hepatitis was predicted by visualized analysis and topological parameter analysis. RESULTS: According to network pharmacology, through directly affecting androgen receptor, tyrosine-protein kinase, caspase-3, interleukin 2, neutrophil elastase, cathepsin K, estrogen receptor, transforming growth factor β-2, wiskott-Aldrich syndrome(WAS) protein, signal transducer and activator of transcription and simultaneously regulating NF-kappa B signaling pathway, T cell receptor signaling pathway, Natural killer cell mediated cytotoxicity, Sancao granules could fully play its role in treatment of autoimmune hepatitis. CONCLUSIONS: Sancao granules can be used for the treatment of autoimmune hepatitis by intervening inflammatory response and mediating inflammation.

Network pharmacology; Sancao granules; Autoimmune hepatitis; Mechanism prediction

國家自然科學基金資助項目(No.81573631、No.81303120)；軍隊十二五面上課題(No.CWS11C164)

R932

A

1672-2124(2017)10-1301-04

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.10.002

2017-08-02)