王瑩瑩，高 天，李 洋，張 璐，周厚琴，陸小華，楊玉雪，趙艷玲(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 61117； 2.解放軍第02醫(yī)院藥學部，北京 10009； .成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

*碩士研究生。研究方向：中藥理論與應(yīng)用研究。E-mail：734044862@qq.com

#通信作者：主任藥師，博士，研究員。研究方向：中藥藥理學。E-mail：zhaoyl2855@126.com

基于分子對接技術(shù)探討丹參治療肝損傷的作用機制Δ

王瑩瑩1,2*，高 天3，李 洋1,2，張 璐1,2，周厚琴1,2，陸小華1,2，楊玉雪1,2，趙艷玲2#
(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137； 2.解放軍第302醫(yī)院藥學部，北京 100039； 3.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

目的：利用分子對接技術(shù)，探討丹參治療肝損傷的作用機制。方法：采用中醫(yī)藥化學數(shù)據(jù)庫和Autodock 4.2軟件，將丹參中丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛等成分分別與枯否細胞表面抗原CD14和信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)進行分子對接。結(jié)果：丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛與CD14結(jié)合的自由能分別為-11.207 76、-8.782 20、-9.827 70、-25.928 40、-16.435 26、-26.137 50和-19.906 32 kJ/mol，與STAT3蛋白結(jié)合的自由能分別為-8.447 64、-14.302 44、-18.275 34、-28.855 80、-18.860 82、-28.604 88和-15.891 60 kJ/mol。結(jié)論：隱丹參酮、二氫丹參酮、原兒茶醛、咖啡酸與CD14具有較小的自由能，結(jié)合作用較強；丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮與STAT3蛋白具有較小的自由能，結(jié)合作用較強。提示丹參治療脂多糖致肝損傷的作用機制可能為其主要成分與CD14及STAT3蛋白具有較強的結(jié)合作用，通過作用于表面受體調(diào)控枯否細胞細胞激活及下游STAT3調(diào)控STAT3通路，從而對損傷的肝臟起到保護和修復作用。本研究為進一步探討丹參治療肝損傷的分子機制提供了參考。

二氫丹參酮； 隱丹參酮； 丹參素； 分子對接； CD14； 信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3

肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，又是新陳代謝的重要器官。目前，肝臟疾病威脅著人類的身體健康，肝損傷的發(fā)病率逐年升高，對于治療肝損傷藥物的研究和開發(fā)受到人們的廣泛關(guān)注[1]。肝損傷是各種肝臟疾病如病毒性肝病、藥物性肝病等共同的病理環(huán)節(jié)，也是脂肪肝、肝硬化、肝腹水及肝癌的直接前期病因和成因，主要由藥物、酒精、生物、病毒、環(huán)境等因素造成[2]。肝損傷最終會導致肝細胞死亡，同時會激活免疫反應(yīng)，導致枯否細胞、自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞等的激活和釋放，以上免疫細胞釋放炎性因子，進入肝臟會加速肝損傷[3-4]。研究結(jié)果顯示，枯否細胞在肝損傷的進程中起到重要作用，在不同致病條件下，枯否細胞在肝臟損傷和修復過程中起到?jīng)Q定性的調(diào)節(jié)作用[5]；活化枯否細胞導致肝損傷是通過增強CD14表達上調(diào)而實現(xiàn)的[6]。CD14是一種糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，作為細胞表面和內(nèi)體中Toll樣受體的輔受體，在枯否細胞中少量表達[7]，其能識別大量細菌產(chǎn)物包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，激活枯否細胞，導致白細胞介素6等炎性因子大量釋放，白細胞介素6激活信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)，通過抑制細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導、抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、促進肝細胞再生等途徑減輕肝損傷[8-9]。下調(diào)枯否細胞CD14的過度表達，以及通過激活STAT3調(diào)控STAT3信號通路，可能會對LPS導致的肝損傷起到保護和損傷后修復作用。

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，用于胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠等[10]。其主要成分包括丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、隱丹參酮等[11]?，F(xiàn)代藥理對于丹參的研究多集中于其抗心肌缺血、抗血栓和動脈粥樣硬化等對心血管系統(tǒng)的影響方面[12]。近年來，關(guān)于丹參保肝作用的研究方興未艾。研究結(jié)果顯示，丹參及其主要成分對四氯化碳、D-氨基半乳糖、醋氨酚、酒精等制備的肝損傷模型也具有明顯的保護作用[13]。同時，丹參制劑對肝病的臨床治療也有一定的效果[14-15]。但是，目前關(guān)于丹參治療肝損傷的作用機制的報道尚不多見。分子對接是依據(jù)E·Fisher于1894年提出的配體與受體作用的“鎖-鑰匙模型”[16]，模擬小分子配體與受體生物大分子相互作用，配體與受體在空間立體結(jié)構(gòu)、靜電作用、范德華力、氫鍵及疏水作用等方面互補匹配，通過計算可以預測兩者之間的結(jié)合模式和親和力，計算結(jié)果可用來評判受體和配體的結(jié)合程度。王婧超等[17]采用分子對接技術(shù)，將6-姜烯酚與核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)分子的活性位點進行柔性對接，證實NF-κB與6-姜烯酚之間存在交互效應(yīng)，6-姜烯酚的生物活性作用可能與抑制NF-κB的活性位點進而抑制其信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。本研究采用Autodock軟件模擬預測丹參中丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛等7種成分與CD14及STAT3的相互作用，為探究丹參治療LPS所致肝損傷的相關(guān)機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

Autodock 4.2軟件來源于美國斯科利普斯研究所(http：//autodock.scripps.edu)，為免費授權(quán)的軟件；STAT蛋白結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/pdb)；丹參素中化合物結(jié)構(gòu)來源于中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(http：//tcm.cmu.edu.tw)。軟件運行于Linux操作系統(tǒng)平臺下。相關(guān)軟件均為已授權(quán)或免費授權(quán)。

1.2方法

1.2.1 結(jié)構(gòu)預處理：在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，搜索并下載CD14、STAT3蛋白結(jié)構(gòu)文件。CD14，蛋白號為4GLP，見圖1(A)；STAT3，蛋白號為4ZIA，見圖1(B)。從中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫下載丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛的分子結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Chem 3D軟件，對這些分子結(jié)構(gòu)進行能量優(yōu)化，保存。

A.CD14蛋白；B.STAT3蛋白A.CD14 protein; B.STAT3 protein圖1 CD14、STAT3蛋白結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of CD14 and STAT3 protein

1.2.2 Autodock分子對接：在Linux終端下運行Autodock 4.2軟件，依次加載潔凈蛋白和能量優(yōu)化后的化合物(配體)，用Autogrid計算格點能量，對接運算采用拉馬克遺傳算法，各化合物與蛋白之間的結(jié)合情況用半經(jīng)驗的自由能評價方法評價。參數(shù)設(shè)置過程中，將參數(shù)“能量最大評價次數(shù)”確定為“2 500 000”，運行次數(shù)確定為“100”，其他參數(shù)采用軟件的默認設(shè)置。根據(jù)相關(guān)文獻，確定各蛋白活性口袋的氨基酸殘基和中心點坐標(X，Y，Z)：4GLP的氨基酸殘基為Phe69、Lys71、Lys72、Gln81、Tyr82、Thr85、Leu89、Val52、Phe49、Ser46、Trp45、Asp44、Pro43和Gln42，中心點為(44.725，61.587，-4.448)；4ZIA的氨基酸殘基為Glu29、Met28、His19、Leu18、Leu15、Leu10、Gln8、Trp4、Gln8、Trp4、Gln32、Phe33、Tyr79、Leu78和Val77，中心點為(129.829，61.53，128.121)。

2 結(jié)果

2.1與CD14(4GLP)受體分子的對接信息

經(jīng)過Autodock軟件運算分析，得到CD14與配體丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛結(jié)合的復合結(jié)果。結(jié)果顯示，最佳結(jié)合自由能取第1個值分別為-11.207 76、-8.782 20、-9.827 70、-25.928 40、-16.435 26、-26.137 50和-19.906 32 kJ/mol，與之相對應(yīng)的抑制常數(shù)分別為1.09×104、2.88×104、1.90×104、28.52、1.32×103、26.01和3.26×102μmol/L，見表1。可見，隱丹參酮具有較小的抑制常數(shù)，為26.01μmol/L，對CD14具有較強的抑制作用。通過Autodock自帶的分析程序，得到了CD14蛋白與配體丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮和咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛的對接構(gòu)象及其相關(guān)作用方式，見圖2—3。結(jié)合圖2(B)的空間構(gòu)型和表1的對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B與CD14中氨基酸殘基Ala109、Ala99、His60和Ile59有相互作用；結(jié)合圖3(A)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B與Ala109、His60氨基酸殘基均存在氫鍵作用，氫鍵鍵長分別為2.94、2.59 A，有數(shù)個氨基酸殘基與丹酚酸B之間具有疏水作用沒有形成相關(guān)配位鍵或氫鍵。如圖2(C)所示，丹酚酸D與CD14中Ala48、Val86的氨基酸殘基有相應(yīng)的相互作用；結(jié)合圖3(B)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸D與Ala48、Thr85之間各形成2個氫鍵，氫鍵鍵長分別為2.81、2.73、2.90和2.77 A。如圖2(D)所示，丹參素與CD14中Cys51、Val73和Ser53的氨基酸殘基之間存在相互作用；結(jié)合圖3(C)發(fā)現(xiàn)，丹參素與Cys51、Val73和Ser53具有氫鍵相互作用，其中與Cys51、Ser53具有多氫鍵的交互作用。由圖2(E)、圖3(D)可見，二氫丹參酮與數(shù)個氨基酸殘基之間具有疏水作用沒有形成相關(guān)配位鍵或氫鍵。如圖2(F)所示，咖啡酸與Ala61、Asn65和Gly62的氨基酸殘基具有相互作用；結(jié)合圖3(E)發(fā)現(xiàn)，咖啡酸與Ala61、Asn65、Gly62和Gly63之間存在氫鍵的相互作用，鍵長分別為2.64、2.79、2.53和2.92 A。由圖2(G)、圖3(F)可見，有數(shù)個氨基酸殘基與隱丹參酮之間具有疏水作用沒有形成相關(guān)配位鍵或氫鍵。如圖2(H)所示，原兒茶醛與Glu40、Pro43和Glu47的氨基酸殘基之間存在相互作用；結(jié)合圖3(G)發(fā)現(xiàn)，原兒茶醛與Glu47、Glu40具有氫鍵相互作用，其中與Glu47具有多氫鍵的交互作用，鍵長分別為2.57、2.78 A。

表1 丹參中7種成分與CD14(4GLP)受體分子的對接信息Tab 1 Docking information between 7 ingredients in Radix salviae miltiorrhizae and CD14 protein(4GLP) receptor molecular

A.CD14；B.丹酚酸B；C.丹酚酸D；D.丹參素；E.二氫丹參酮；F.咖啡酸；G.隱丹參酮；H.原兒茶醛A.CD14 protein; B.salvianolic acid B; C.salvianolic acid D; D.tanshinol; E.dihydrotanshinone; F.caffeic acid; G.cryptotanshinone; H.protocatechualdehyde圖2 丹參中7種成分與CD14(4GLP)的對接空間位置示意圖Fig 2 Docking space position between 7 ingredients in Radix salviae miltiorrhizae and CD14 protein(4GLP) receptor molecular

A.丹酚酸B；B.丹酚酸D；C.丹參素；D.二氫丹參酮；E.咖啡酸；F.隱丹參酮；G.原兒茶醛A.salvianolic acid B；B.salvianolic acid D；C.tanshinol; D.dihydrotanshinone; E.caffeic acid; F.cryptotanshinone; G.protocatechualdehyde圖3 丹參中7種成分與CD14(4GLP)的對接交互作用二維平面圖Fig 3 2D plane picture of docking interaction between 7 ingredients in Radix salviae miltiorrhizae and CD14 protein(4GLP) receptor molecular

2.2與STAT3(4ZIA)分子的對接信息

經(jīng)過Autodock軟件的運算分析，得到丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛與STAT3蛋白結(jié)合的復合結(jié)果。對接信息包括半經(jīng)驗化的自由能評價評分、抑制常數(shù)值和對接模擬溫度。對于多構(gòu)象的對接結(jié)果，取最佳對接構(gòu)象結(jié)果。結(jié)果顯示，丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛與STAT3的結(jié)合自由能取其第1個值，分別為-8.447 64、-14.302 44、-18.275 34、-28.855 80、-18.860 82、-28.604 88和-15.891 60 kJ/mol，抑制常數(shù)分別為3.32×104、3.11×103、6.27×102、8.71、4.95×102、9.74和1.63×103μmol/L，見表2?？梢?，二氫丹參酮對STAT3有較低的抑制常數(shù)和較強的抑制作用。通過Autodock自帶的分析程序，得到了STAT3蛋白與配體丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸、隱丹參酮和原兒茶醛的最佳對接構(gòu)象及其相關(guān)作用方式，見圖4—5。如圖4(B)所示，丹酚酸B與STAT3的氨基酸殘基Asn76、Arg70有相互作用；結(jié)合圖5(A)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B與Asn76、Arg70和Gly1均存在多氫鍵的交互作用，氫鍵鍵長分別為2.83、2.56、3.03、2.65、3.11和2.91 A。如圖4(C)所示，丹酚酸D與Asn5、Arg70氨基酸殘基有相互作用；結(jié)合圖5(B)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸D與Asn5、Arg70、Met28和Gly1具有氫鍵相互作用，其中與Asn5、Arg70、Gly1形成多氫鍵的交互作用。如圖4(D)所示，丹參素與氨基酸殘基Gln9、Leu7、Asp11和Tyr22具有相互作用；結(jié)合圖5(C)發(fā)現(xiàn)，丹參素與Leu7、Tyr22和Leu10具有氫鍵相互作用，氫鍵鍵長分別為2.97、2.71和2.68 A。由圖4(E)、圖5(D)可見，二氫丹參酮與氨基酸殘基Asp11具有相互作用，僅與數(shù)個氨基酸殘基之間具有疏水作用但沒有形成相關(guān)配位鍵或氫鍵。如圖4(F)所示，咖啡酸與Gln20、Asp24和Arg85氨基酸殘基有相互作用，結(jié)合二維平面結(jié)果發(fā)現(xiàn)，咖啡酸與Asp24、Arg85和His19存在氫鍵的相互作用，其中與His19具有多氫鍵的交互作用。由圖4(G)、圖5(F)可見，隱丹參酮僅與數(shù)個氨基酸殘基之間具有疏水作用但沒有形成相關(guān)配位鍵或氫鍵。如圖4(H)所示，原兒茶醛與Leu7、Leu115的氨基酸殘基具有相互作用；結(jié)合圖5(H)發(fā)現(xiàn)，原兒茶醛與Leu7之間具有多氫鍵的交互作用，鍵長分別為2.71、2.75 A。

表2 丹參中7種成分與STAT3(4ZIA)分子的對接信息Tab 2 Docking information between 7 ingredients in Radix salviae miltiorrhizae and STAT3 protein(4ZIA) receptor molecular

A.STAT3蛋白；B.丹酚酸B；C.丹酚酸D；D.丹參素；E.二氫丹參酮；F.咖啡酸；G.隱丹參酮；H.原兒茶醛A.STAT3 protein; B.salvianolic acid B; C.salvianolic acid D; D.tanshinol; E.dihydrotanshinone; F.caffeic acid; G.cryptotanshinone; H.protocatechualdehyde圖4 丹參中7種成分與STAT3(4ZIA)的對接空間位置示意圖Fig 4 Docking space position between 7 ingredients in Radix salviae miltiorrhizae and STAT3 protein(4ZIA)

A.丹酚酸B；B.丹酚酸D；C.丹參素；D.二氫丹參酮；E.咖啡酸；F.隱丹參酮；G.原兒茶醛A.salvianolic acid B；B.salvianolic acid D; C.tanshinol; D.dihydrotanshinone; E.caffeic acid; F.cryptotanshinone; G.protocatechualdehyde圖5 丹參中7種成分與STAT3(4ZIA)的對接交互作用二維平面圖Fig 5 2D plane picture of docking interaction between 7 ingredients in Radix salviae miltiorrhizae and STAT3 protein(4ZIA)

3 討論

分子對接方法作為直接藥物設(shè)計方法，是一種應(yīng)用較為成熟的計算機輔助藥物設(shè)計的主要方法。其主要基于計算機技術(shù)，通過化學計量學方法模擬分子的幾何結(jié)構(gòu)和分子間作用力，研究分子間的相互作用，尋找小分子配體與大分子受體活性位點的低能結(jié)合模式[18]。分子對接技術(shù)通過預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點，在探索作用機制方面具有重要意義，目前已被廣泛應(yīng)用于中藥研究[19-20]、新藥開發(fā)[21]等領(lǐng)域。

丹參是重要的傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)有“一味丹參，功同四物”之說，其具有較強的抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等活性，被廣泛用于心血管疾病的治療。目前不少研究結(jié)果顯示，丹參及其化學成分對發(fā)生肝損傷[22]、肝纖維化[23]患者的肝臟具有一定的保護作用。STAT3是細胞轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄活化子家族的一員，其激活在肝損傷后修復過程中發(fā)揮重要作用；CD14是枯否細胞上LPS受體，LPS與CD14結(jié)合可激活枯否細胞，釋放炎性因子，從而激活STAT3及相關(guān)信號通路。丹參及其主要成分是否會通過作用于CD14及其下游蛋白STAT3來調(diào)控相關(guān)信號通路，從而對LPS致?lián)p傷的肝臟具有保護和修復作用，目前尚無文獻報道。本研究通過分子對接技術(shù)模擬分析丹參中主要成分與CD14和STAT3的相互作用和空間構(gòu)象，結(jié)果提示，丹參素、二氫丹參酮、咖啡酸和隱丹參酮與STAT3蛋白具有較小的自由能和抑制常數(shù)，結(jié)合作用較強；隱丹參酮、二氫丹參酮、原兒茶醛和咖啡酸與CD14具有較小的自由能和抑制常數(shù)，結(jié)合作用較強。提示丹參治療LPS致肝損傷的作用機制可能為其主要成分與CD14以及STAT3蛋白具有較強的結(jié)合作用，通過作用于表面受體CD14調(diào)控枯否細胞細胞激活，以及作用于下游STAT3調(diào)控STAT3通路，從而對損傷的肝臟起到保護和修復作用。

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MechanismofRadixSalviaeMiltiorrhizaeinTreatmentofLiverInjuryBasedonMolecularDockingTechnologyΔ

WANG Yingying1，2, GAO Tian3, LI Yang1，2, ZHANG Lu1，2, ZHOU Houqin1，2, LU Xiaohua1，2, YANG Yuxue1，2, ZHAO Yanling2
(1.College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Chengdu 611137, China; 2.Dept. of Pharmacy, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China; 3.the Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 610072, China)

OBJECTIVE: To probe into the mechanism of Radix salviae miltiorrhizae in treatment of liver injury based on molecular docking technology. METHODS: By using Chinese Medicine Chemistry Database and Autodock 4.2 software, molecular docking was respectively conducted between salvianolic acid B, salvianolic acid D, tanshinol, dihydrotanshinone, caffeic acid, cryptotanshinone, protocatechualdehyde in Radix salviae miltiorrhizae and CD14 and signal transducer and activator of transcription (STAT3). RESULTS: The free energy of salvianolic acid B, salvianolic acid D, tanshinol, dihydrotanshinone, caffeic acid, cryptotanshinone, protocatechualdehyde combined with CD14 were respectively -11.207 76 kJ/mol, -8.782 20 kJ/mol, -9.827 70 kJ/mol, -25.928 40 kJ/mol, -16.435 26 kJ/mol, -26.137 50 kJ/mol and -19.906 32 kJ/mol, yet with STAT3 were respectively -8.447 64 kJ/mol, -14.302 44 kJ/mol, -18.275 34 kJ/mol, -28.855 80 kJ/mol, -18.860 82 kJ/mol, -28.604 88 kJ/mol and -15.891 60 kJ/mol. CONCLUSIONS: Cryptotan-shinone, dihydrotanshinone, protocatechualdehyde, caffeic acid showed low free energy and high interaction with CD14; and tanshinol, dihydrotanshinone, caffeic acid, cryptotanshinone showed low free energy and high interaction with STAT3.It is indicated that the mechanism of Radix salviae miltiorrhizae in treatment of liver injury induced by LPS are probably related to the combination of main active ingredient with CD14 and STAT3 protein, through regulating the Kupffer cells and mediating STAT3 signal pathway to protect and repair the liver. This study provides reference for the further investigation on Radix salviae miltiorrhizae in treatment of liver injury.

Dihydrotanshinone; Cryptotanshinone; Tanshinol; Molecular docking; CD14; STAT3

國家自然科學基金資助項目(No.81573631、No.81303120)

R932

A

1672-2124(2017)10-1307-05

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.10.004

2017-08-02)