張治軍，周文杰，李志蕓（.廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西桂林5400；.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林54004）

UPLC-MS法檢測(cè)動(dòng)物類藥材中氯霉素類藥物殘留Δ

張治軍1＊，周文杰1，李志蕓2（1.廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西桂林541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林541004）

目的：建立檢測(cè)動(dòng)物類藥材中氯霉素類藥物殘留的方法。方法：采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法。色譜柱為SB-C18，流動(dòng)相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20 μL；離子源為電噴霧離子源，干燥氣溫度為350℃，干燥氣流量為5 L/min，鞘氣溫度為250℃，鞘氣流量為11 L/min，毛細(xì)管電壓為3 500 V，負(fù)離子掃描方式，多反應(yīng)檢測(cè)模式。結(jié)果：氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍均為0.5～15 ng/mL（r分別為0.999 8、0.999 9、0.998 9）；定量限分別為0.03、0.03、0.15 μg/kg，檢測(cè)限分別為0.01、0.01、0.05 μg/kg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；回收率分別為84.00%～112.80%（RSD＝10.15%，n＝9）、88.24%～109.80%（RSD＝7.11%，n＝9）、88.24%～99.02%（RSD＝3.91%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于動(dòng)物類藥材中氯霉素類藥物殘留的檢測(cè)。

動(dòng)物類藥材；氯霉素類藥物殘留；超高效液相色譜-質(zhì)譜法

動(dòng)物類藥材的應(yīng)用在我國(guó)有著悠久歷史，在中藥材的發(fā)展史中有著重要的地位。隨著自然資源的匱乏，不少動(dòng)物類藥材來(lái)源由野生變?yōu)槿斯ゐB(yǎng)殖。但在養(yǎng)殖過(guò)程中，有些不法商家為了追求不正當(dāng)利益，非法過(guò)量使用抗生素、雌激素等化學(xué)藥物，從而造成相關(guān)藥物殘留，最終可能對(duì)人體造成損害。而氯霉素類藥物因具有廣譜抗菌能力，價(jià)格便宜，抑菌效果好，常被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)。這類藥物性質(zhì)穩(wěn)定、不易降解，極易造成殘留。已有研究證明，長(zhǎng)期攝入氯霉素類藥物會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷人體造血機(jī)能，可引起粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血，同時(shí)對(duì)消化系統(tǒng)也具有較嚴(yán)重的毒副作用[1-3]。因此，歐盟國(guó)家、美國(guó)、我國(guó)及其他一些國(guó)家嚴(yán)禁該類藥物在食用動(dòng)物上使用，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告（2002年）中明確把氯霉素列為食品動(dòng)物養(yǎng)殖中的禁用藥物[4]。但是對(duì)于動(dòng)物類藥材，有關(guān)氯霉素類藥物殘留的檢測(cè)研究目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以常用動(dòng)物類藥材雞內(nèi)金、土鱉蟲(chóng)、地龍、水蛭為例，建立了以超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS）同時(shí)測(cè)定其中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素殘留的方法，并對(duì)市售120批動(dòng)物類藥材進(jìn)行了檢測(cè)，旨在為動(dòng)物類藥材中氯霉素類藥物殘留的檢測(cè)和控制提出參考。

1 材料

1.1 儀器

1290Infinity型UPLC儀和6460型三重四極桿MS儀（美國(guó)Agilent公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；3-30K型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 試劑

氯霉素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130555-201203，純度：99.80%）；氟甲砜霉素對(duì)照品（批號(hào)：01103，純度：99.0%）、甲砜霉素對(duì)照品（批號(hào)：01103，純度：98.5%）、D5-氯霉素對(duì)照品（批號(hào)：10307AC，純度：99.0%）均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

地龍、水蛭、雞內(nèi)金、土鱉蟲(chóng)藥材各30批，均購(gòu)于廣西不同地區(qū)藥店和藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西桂林食品藥品檢驗(yàn)所饒偉文主任藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：SB-C1（850 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～3 min，25%→70%A；3～5 min，70%→95%A；5～8 min，95%→25%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：5 L/min；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流量：11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V；負(fù)離子掃描方式，多反應(yīng)檢測(cè)模式。質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液精密稱取待測(cè)成分對(duì)照品各10.0 mg，置于20 mL量瓶中，加D5-氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液（10 ng/mL）0.10 mL，加乙腈溶解并定容，搖勻，制成氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素質(zhì)量濃度均為500 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取藥材樣品2.0 g，置于50 mL離心管中，加D5-氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液（10 ng/mL）0.10 mL，加堿化乙酸乙酯溶液（乙酸乙酯-25%氨水，97∶3，V/V，下同）25 mL，渦旋后水平振蕩5 min，以半徑12 cm、5 000 r/min離心10 min，取上清液，于45水浴氮?dú)獯蹈?；殘?jiān)訅A化乙酸乙酯溶液25 mL，渦旋后水平振蕩5 min，以半徑12 cm、5 000 r/min離心10 min，取上清液；合并上述上清液，于45℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?%氯化鈉溶液5 mL溶解，加正己烷萃取2次，每次5 mL，棄去正己烷，再加乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯萃取液，于45℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)? mL水溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

表1 質(zhì)譜分析參數(shù)Tab 1 Mass spectrometry analysis conditions

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，氯霉素、氟甲砜霉素與甲砜霉素色譜峰可達(dá)到很好的分離，℃且無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

圖1 提取離子流圖Fig 1 Extraction particle flow graph

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加乙腈制成氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素質(zhì)量濃度均為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 ng/mL的系列混合對(duì)照品溶液（均含D5-氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液10 ng/mL）。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素回歸方程分別為y＝1.909 674x－0.000 299 161（r＝0.999 8）、y＝3.926 487x+0.007 515（r＝0.999 9）、y＝0.658 704x+0.004 180（r＝0.998 9）。結(jié)果表明，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍均為0.5～15 ng/mL。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素定量限分別為0.03、0.03、0.15 μg/kg，檢測(cè)限分別為0.01、0.01、0.05 μg/kg。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素峰面積的RSD分別為1.4%、1.5%、2.6%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下土鱉蟲(chóng)藥材供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素峰面積的RSD分別為1.6%、1.3%、1.5%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批土鱉蟲(chóng)藥材樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素峰面積的RSD分別為2.4%、1.8%、2.2%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

分別取低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 藥材樣品中氯霉素類藥物殘留量檢測(cè)

取120批藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表3（表中僅列檢出氯霉素類藥物殘留的藥材樣品）。

由表3可知，檢出氯霉素類藥物殘留的雞內(nèi)金藥材有18批（檢出率為60%）、地龍藥材7批（檢出率為23%）、土鱉蟲(chóng)藥材4批（檢出率為13%）、水蛭藥材4批（檢出率為13%）。

3 討論

由于動(dòng)物養(yǎng)殖者一味地追求經(jīng)濟(jì)利益，氯霉素類藥物有意無(wú)意濫用現(xiàn)象在當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)中普遍存在。同時(shí)，環(huán)境水質(zhì)、土壤的污染也是造成該類藥物殘留的一個(gè)重要原因[5-8]。這兩種原因極易導(dǎo)致動(dòng)物類藥材中該類藥物殘留，甚至在含動(dòng)物類藥材較多的制劑中也會(huì)有氯霉素類藥物殘留[9]。從本試驗(yàn)收集的藥材樣品檢測(cè)結(jié)果可知，動(dòng)物類藥材中存在氯霉素類藥物殘留的現(xiàn)象比較普遍，其中雞內(nèi)金藥材的殘留情況最嚴(yán)重。因此，建議有關(guān)監(jiān)管部門給予足夠重視。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 藥材樣品中氯霉素類藥物殘留量檢測(cè)結(jié)果（n＝3，μg/kg）Tab 3 Results of chloramphenicol residue in medicinal herbs samples（n＝3，μg/kg）

續(xù)表3Continued Tab 3

氯霉素類藥物屬于弱極性或弱堿性化合物，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。相關(guān)文獻(xiàn)[10-15]報(bào)道的提取方法多采用乙腈或乙酸乙酯提取，并經(jīng)固相萃取或正己烷液液萃取去除雜質(zhì)。本試驗(yàn)曾比較了幾種方法的提取效果，但結(jié)果要么基質(zhì)效應(yīng)很大，要么需要通過(guò)固相萃取柱凈化，操作煩瑣。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用乙酸乙酯加氨水提取藥材樣品，正己烷脫脂，乙酸乙酯萃取，操作簡(jiǎn)便，同時(shí)可消除藥材樣品的大部分基質(zhì)效應(yīng)，能得到較好的回收率和檢測(cè)限。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于動(dòng)物類藥材中氯霉素類藥物殘留的檢測(cè)。

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Determination of Chloramphenicol Residue in Animal Medicinal Herbs by UPLC-MS

ZHANG Zhijun1，ZHOU Wenjie1，LI Zhiyun2（1.Guangxi Guilin Institute for Food and Drug Control，Guangxi Guilin 541001，China；2.College of Pharmacy，Guilin Medical University，Guangxi Guilin 541004，China）

OBJECTIVE：To establish the method for determination of chloramphenicol residue in animal medicinal herbs.METHODS：UPLC-MS method was adopted.The determination was performed on SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 0.2 mL/min.The column temperature was 35℃，and sample size was 20 μL.The ion source was a jet stream ion focusing electrospray ion source.The temperature and flow of drying gas were 350℃and 5 L/min，and those of sheath gas were 250℃，11 L/min，and capillary voltage was 3 500 V.Negative ion scanning mode was conducted with multiple reaction monitoring（MRM）mode.RESULTS：The linear ranges of thiamphenicol，florfenicol and chloramphenicol were 0.5-15 ng/mL（r were 0.999 8，0.999 9，0.998 9，respectively）.The limits of quantitation were 0.03，0.03，0.15 μg/kg，and the limits of detection were 0.01，0.01，0.05 μg/kg.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.The recoveries were 84.00%-112.80%（RSD＝10.15%，n＝9），88.24%-109.80%（RSD＝7.11%，n＝9），88.24%-99.02%（RSD＝3.91%，n＝9）。CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for determination of chloramphenicol in animal medicinal herbs.

Animal medicinal herbs；Chloramphenicol residue；UPLC-MS

R927

A

1001-0408（2017）30-4271-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.25

廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局科研項(xiàng)目（No.桂食藥監(jiān)科評(píng)函〔2015〕20號(hào)）

＊副主任中藥師。研究方向：藥品質(zhì)量檢驗(yàn)、控制。E-mail：770013802@qq.com

2017-01-24

2017-04-06）

（編輯：張靜）