姚小麗，張素中，魏潔書，張善添

（中山大學(xué)新華學(xué)院藥學(xué)系，廣東廣州510520）

辣木葉總黃酮對酪氨酸酶的抑制及抗氧化活性研究

姚小麗，張素中＊，魏潔書，張善添

（中山大學(xué)新華學(xué)院藥學(xué)系，廣東廣州510520）

本文采用DPPH法及酪氨酸酶對L-多巴轉(zhuǎn)化活性影響測定法對辣木葉總黃酮的粗提物進(jìn)行生物活性測試，評價(jià)其抗氧化性及對酪氨酸酶的抑制效果。結(jié)果表明辣木葉總黃酮的粗提物具一定的抗氧化性，對DPPH消除率IC50為0.0022mg/mL，辣木葉總黃酮粗提物對酪氨酸酶的抑制率IC50為335μg/mL，對酪氨酸酶的抑制作用為隨著濃度增大而增大。辣木葉總黃酮粗提物具抗衰老及祛斑美白功效，在美容方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

辣木葉；總黃酮；抗氧化性；酪氨酸酶；抑制

隨著年齡的增加，機(jī)體保護(hù)機(jī)制逐漸下降。體內(nèi)生理性損傷，特別是脂質(zhì)過氧反應(yīng)，即內(nèi)源性超氧自由基作用于機(jī)體中的不飽和脂肪酸，產(chǎn)生不穩(wěn)定的過氧化脂質(zhì)，進(jìn)而分解產(chǎn)生丙二醛等醛類，它通過攻擊磷脂和蛋白質(zhì)，反應(yīng)生成脂質(zhì)蛋白復(fù)合物，脂褐素沉積于細(xì)胞內(nèi)，成為細(xì)胞老化的標(biāo)志。因此，抗氧化一直是預(yù)防和治療皮膚老化的有力手段，也是其他許多化合物達(dá)到抗皮膚老化作用的重要途徑。相關(guān)研究表明，黃酮類物質(zhì)有較強(qiáng)的抗氧化性，提示了黃酮類物質(zhì)有一定的抗皮膚老化作用效果[1]。

污染嚴(yán)重對人的肌膚造成很大影響，包括膚色變黃、暗淡，皮膚老化、沒有光澤等，嚴(yán)重甚至出現(xiàn)色斑。黑色素是影響皮膚的主要因素，酪氨酸酶是機(jī)體合成黑色素的主要酶，抑制酪氨酸酶活性可以減少機(jī)體黑色素的形成，達(dá)到一定的美白袪斑效果[2]。根據(jù)相關(guān)研究表明，黃酮類物質(zhì)對酪氨酸酶的活性有比較強(qiáng)的抑制作用，說明黃酮類物質(zhì)有一定的美白祛斑效果。

本研究通過測試?yán)蹦救~中總黃酮粗提取的生物活性，為辣木植物資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，也為從中篩選出美白祛斑抗老化的天然護(hù)膚品提供了有力依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號：PHS-3S）、酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司，型號：Multiskan FC型）、紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司，型號：UV6000）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 材料與試劑

辣木葉，為辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa）辣木Moringa oleifera Lam，引種印度辣木，中山大學(xué)新華學(xué)院藥圃園自種。

酪氨酸酶（江萊生物，批號：JL161014004）、曲酸（上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，批號：Y151225A）、L-多巴（江萊生物，批號：JL160519015）、DPPH（江萊生物，批號：JL161020021）、維生素C對照品（江萊生物，批號：JL160915005）、蘆丁對照品（酷爾生物，批號：B154199）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 辣木葉總黃酮的粗提物的制備

將新鮮的辣木葉洗凈，于60℃烘干，粉碎成粗粉備用。取辣木葉粗粉10g，加入70%乙醇，物料比為1∶10，提取溫度為52℃，提取時(shí)間為40min，提取液過濾，將濾液減壓真空濃縮至50mL，得辣木葉總黃酮的粗提取物（總黃酮含量為427mg/mL），作為待測物。

2.2 辣木葉總黃酮的粗提物的生物活性測定

2.2.1 抗氧化性[3][4]

檢測液的配制：用無水乙醇分別配制成0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.009mg/mL和0.010mg/mL濃度的辣木總黃酮的待測液。

對照液的配制：精密稱取維生素C對照品0.100mg，用無水乙醇定容至10mL。再分別用無水乙醇配制成0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.009mg/mL和0.010mg/mL濃度的維生素C對照液。

測定：取上述待測液或?qū)φ找?mL，分別加入2mL的DPPH溶液，搖勻，室溫下暗處靜置30min后測定其吸光度A樣品，同時(shí)測定2mL DPPH溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度A空白，以及2mL測試樣品溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度A空白。以上數(shù)據(jù)均以無水乙醇為空白對照測量吸光度。分別計(jì)算維生素C和辣木總黃酮對DPPH的清除率S。

2.2.2 對酪氨酸酶的抑制作用[5][6]

酪氨酸酶的活力的測定：以0.5mmol/L L-多巴為底物，以曲酸為對照品，取曲酸配制成70、80、90、100、110、120μg/mL和130μg/mL濃度的系列對照品溶液；將辣木總黃酮提取物配制成200、250、300、350、400、450μg/mL和500μg/mL濃度的系列樣品溶液；將酪氨酸酶配制成濃度為6.67μg/mL的溶液。（注：L-多巴溶液、酶溶液及樣品溶液均以50mmol/L磷酸緩沖液（pH=6.8）配制）。按表1組成進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)的條件為混勻后在37℃水浴保溫30min，按照每組反應(yīng)時(shí)間為1min用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，檢測波長為475nm，記錄吸光度A，并計(jì)算抑制率（%）。

公式（2）中，A1：未加樣品的加酶混合液所測的吸光度；A2：未加樣品和酶的混合液所測的吸光度；A3：加樣品和酶的混合液所測的吸光度；A4：加樣品而未加酶的混合液所測的吸光度。

表1 各組反應(yīng)液組成

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 抗氧化性的測定

由圖1可知，維生素C濃度大于0.008mg/mL后清除率增加緩慢并趨于平穩(wěn)，由圖2可知，總黃酮提取物濃度大于0.004mg/mL后清除率增加緩慢并趨于平穩(wěn)。對比圖1與圖2可知，圖2曲線更陡更快趨于平穩(wěn)，再比較維生素C和辣木總黃酮的IC50，維生素C為0.006 6mg/mL，辣木總黃酮為0.0 022mg/mL，表明辣木總黃酮的對DPPH清除率更好、抗氧化能力更強(qiáng)。

圖1 維生素C對DPPH的清除率曲線

圖2 辣木總黃酮對DPPH的清除率曲線

3.2 對酪氨酸酶抑制的作用

由圖3可知，曲酸對酪氨酸酶的抑制作用隨著曲酸的濃度增大而增大，對酪氨酸酶IC50為70μg/mL。由圖4可知，辣木總黃酮對酪氨酸酶的抑制作用為隨著濃度增大而增大，對酪氨酸酶IC50為335μg/mL?？梢?，辣木總黃酮的作用還是相當(dāng)明顯的，其對酪氨酸酶的抑制機(jī)制作用與曲酸相似。

圖3 不同濃度曲酸對酪氨酸酶抑制率曲線

圖4 不同濃度辣木總黃酮對酪氨酸酶抑制率曲線

4 討論

酪氨酸酶是生物合成黑色素細(xì)胞的主要限速酶。酪氨酸酶活性增加，產(chǎn)生的黑色素就會更多；活性被抑制，黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素的能力就相應(yīng)降低。目前市場上美白藥物主要是通過抑制酪氨酸酶活性達(dá)到美白效果。內(nèi)源性超氧自由基作用于機(jī)體中的不飽和脂肪酸，產(chǎn)生不穩(wěn)定的過氧化脂質(zhì)，進(jìn)而分解產(chǎn)生醛類，它通過攻擊磷脂和蛋白質(zhì)，反應(yīng)形成脂質(zhì)蛋白復(fù)合物，使脂褐素沉積于細(xì)胞內(nèi)，成為細(xì)胞老化的標(biāo)志?？寡趸瞧渌S多化合物達(dá)到抗皮膚老化作用的重要途徑。

通過前期的研究，發(fā)現(xiàn)辣木葉中總黃酮的含量達(dá)4.27%以上，具有很高的開發(fā)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辣木總黃酮的抗氧化性及對酪氨酸酶的抑制作用較佳。其中辣木葉總黃酮和維生素C的IC50相比較，維生素C為0.0 066mg/mL，辣木葉總黃酮為0.0 022mg/mL，提示辣木總黃酮對DPPH清除率更好、抗氧化能力更強(qiáng)；辣木總黃酮對酪氨酸酶的活性存在一定的抑制作用，且隨著濃度增大而增大，對酶的抑制作用顯著增強(qiáng)，對酪氨酸酶IC50為335μg/mL?？梢?，辣木總黃酮的作用還是相當(dāng)明顯的。

綜上所述，辣木葉總黃酮具有美白祛斑、抗衰老作用，因此，從辣木葉中提取總黃酮作為美白祛斑、抗衰老成分，既符合當(dāng)前以天然藥物為美容成分的發(fā)展趨勢，也為辣木的運(yùn)用開發(fā)相關(guān)產(chǎn)業(yè)提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]唐津忠,魯曉翔,陳瑞芳.金蓮花中黃酮類化合物的提取及其抗氧化性研究[J].食品科學(xué),2003(6):88-91.

[2]萬明,宋永鋼,楊菠.黃酮類化合物的藥理作用及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].江西食品工業(yè),2007(3):47-49.

[3]韋獻(xiàn)雅,殷麗琴,鐘成,等.DPPH法評價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2014(9):317-322.

[4]繆成貴,陳慶榆,何華奇.采用DPPH法測定四大藥用名菊抗氧化活性[J].安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2012(4):39-42.

[5]曹偉偉,朱曉娜,李明靜.幾種天然植物提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用[J].化學(xué)研究,2013(3):288-292.

[6]劉英華,歐陽紅,徐慶,等.桑葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用[J].中國臨床康復(fù),2005(3):164-165.

Inhibitory and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Leaves of Moringa Oleiferaon Tyrosinase

Yao Xiao-li，Zhang Su-zhong*，Wei Jie-shu，Zhang Shan-tian
(Department of pharmacy,Xinhua College of Sun Yat-sen University，Guangdong Guangzhou 510520)

In this paper,using the method of DPPH and tyrosinase conversion activity effect on L- DOPA determination of total flavonoids from leaves of Moringa oleifera extracts were tested for biological activity,evaluate its antioxidant activity and inhibitory effect on tyrosinase.The results showed that the total flavonoids from leaves of Moringa oleifera extract has antioxidant properties,the DPPH elimination rate of IC50was 0.0022mg/mL,inhibition of total flavonoids of Moringa oleifera extracts on tyrosinase rate of IC50was 335 μg/mL,inhibition of tyrosinase was increased with the increase of the concentration of.Total flavonoids of Moringa oleifera extracts with anti-aging and whitening effect,and has potential application value in beauty.

Moleifera;Total flavonoids;Antioxidation;Tyrosinase;Inhibition

R284

A

2096-0387（2017）05-0023-03

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2015CX013）。

姚小麗（1992—），女，廣東吳川人，本科，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：藥劑藥分。

張素中（1969—），女，廣東梅州人，碩士，高級工程師，研究方向：中藥新藥藥制劑及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。