曾善榮，胡居吾

（1、贛州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西贛州 341000；2.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

水酶結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油工藝的研究

曾善榮1，胡居吾2

（1、贛州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西贛州 341000；2.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

以蔓荊子為原料，采用水酶結(jié)合溶劑的方法從蔓荊子中提取蔓荊子油?？疾炝肆弦罕取⒚附鈺r(shí)間及酶用量對(duì)蔓荊子油得率的影響，并采用響應(yīng)面法建立了蔓荊子油得率與料液比、酶解時(shí)間及酶用量之間的關(guān)系，得到了最佳萃取工藝條件：液料比8.4:1、酶解時(shí)間105 min、酶用量1.1%，蔓荊子油的得率達(dá)到4.35%，本方法與直接用正己烷提取蔓荊子相比，所得蔓荊子油具有色澤透明、產(chǎn)品純度高、收率高、污染少等的優(yōu)點(diǎn)。

蔓荊子；響應(yīng)面法

引言

蔓荊子別名：蔓荊實(shí)、荊子、萬荊子、蔓青子、蔓荊、白背木耳、小刀豆藤、白背風(fēng)、白背草。為馬鞭草科植物單葉蔓荊或蔓荊的干燥成熟果實(shí)。主產(chǎn)于江西省、山東省、福建省和浙江省等省。具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、擴(kuò)管和降壓 、降血壓、祛痰平喘、延緩衰老等功效[1-7]。

隨著生物技術(shù)的日新月異以及酶制劑發(fā)展技術(shù)的成熟，其生產(chǎn)價(jià)格逐漸下降，使得它的利用越來越普遍。因此，將相關(guān)的酶制劑應(yīng)用在植物精油方面越來越重視。采用酶法與溶劑浸提法提取蔓荊子油主要分為兩個(gè)過程：首先是酶解過程，在反應(yīng)酶的最適條件下，加入相關(guān)的酶進(jìn)行酶解。其主要機(jī)理是酶使蔓荊子的細(xì)胞壁破碎從而加強(qiáng)蔓荊子細(xì)胞中蔓荊子油脂的流動(dòng)性，便于蔓荊子油從蔓荊子細(xì)胞中游離出來。最后是浸提過程，當(dāng)酶解結(jié)束后，向酶解液中加入少量正己烷溶劑，使酶解液中游離出來的蔓荊子油溶解在正己烷中，再利用漏斗分離和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到蔓荊子油。

本文先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，再采用響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以確定水酶結(jié)合溶劑法浸提蔓荊子油的最佳參數(shù)。本方法與直接采用正己烷提取蔓荊子油的方法相比，所得蔓荊子油具有色澤透明，雜質(zhì)少、收率高、產(chǎn)品純度高、污染小等的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

蔓荊子，江西省都昌縣。

1.2 儀器與試劑

木瓜蛋白酶(酶活力＞3萬U/g)，纖維素酶（酶活力＞3萬U/g），均購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

B-260型恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；DEF-6020型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；BSA-224S型分析天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；TGL-20B-C型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PBS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水酶結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油[8]

將蔓荊子粉碎，將一定量的水加入粉碎后的蔓荊子中，用1mol/L鹽酸調(diào)反應(yīng)體系的pH在5.0，往反應(yīng)體系中加入一定量的纖維素酶在設(shè)定的溫度下進(jìn)行酶解所需的時(shí)間后，再調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值為6.5，隨后將木瓜蛋白酶加入其中，再在所設(shè)定的溫度下進(jìn)行酶解所需的時(shí)間后，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行滅酶處理。反應(yīng)體系冷卻后進(jìn)行離心（離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，離心時(shí)間為10min），收集上層液，并加入適量的正己烷溶劑（用量為：蔓荊子重量/正己烷體積比=1:2，g/ml），然后在常溫下進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后去除正己烷溶劑，獲得蔓荊子油產(chǎn)品。

1.3.2 蔓荊子油得率的測(cè)定

蔓荊子油的得率采用所獲得的蔓荊子油油重與進(jìn)行實(shí)驗(yàn)原料蔓荊子重的比值來測(cè)定，具體計(jì)算公式如下：

得率（%）=（蔓荊子油重/蔓荊子重）×100%

1.3.3 酶搭配方式的選擇

反應(yīng)體系中料液比為1:5，酶解時(shí)間為3h，酶解溫度為50℃。表1是本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中酶的添加方式以及各酶的加入量和酶反應(yīng)pH的值。

表1 酶的種類的篩選Table 1 The selection of enzyme

根據(jù)表1的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后通過蔓荊子油的得率高低來確定較佳的酶種搭配方式。

1.3.4 提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 料液比對(duì)蔓荊子油得率的影響

調(diào)節(jié)料液比分別為1:4、1:5、1:6、1:7、1:8，混合酶加入量為1.0%，pH6.0，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為2h。在不同料液比情況下測(cè)定并計(jì)算蔓荊子油得率。

1.3.4.2 酶解時(shí)間對(duì)蔓荊子油得率的影響

調(diào)節(jié)料液比為1:6，混合酶加入量為1.0%，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間分別為1.0h、1.5 h、2h、2.5h、3.0 h，在不同酶解時(shí)間情況下測(cè)定并計(jì)算蔓荊子油得率。

1.3.4.3 纖維素酶加入量對(duì)蔓荊子油得率的影響

調(diào)節(jié)料液比為1:6，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為2h，酶用量分別為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，在不同酶用量情況下測(cè)定并計(jì)算蔓荊子油得率。

1.3.5 工藝的優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定的最佳的酶加入量、料液比和酶解時(shí)間，根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)因素（酶加入量、料液比和酶解時(shí)間）在三個(gè)不同的水平上的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。通過軟件分析，獲得水酶法結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油的最優(yōu)工藝條件。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 酶的篩選

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過測(cè)定蔓荊子油的得率高低來確定較佳的酶種搭配方式，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Origin7.0所做的圖表如圖1。

圖1 不同的酶對(duì)的蔓荊子油的得率的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the yield of viter rotundifolia oil

蔓荊子細(xì)胞壁主要由半纖維素和纖維素組成，此外，還含有少量的蛋白質(zhì)等。存在于蔓荊子細(xì)胞內(nèi)的油脂與一些蔓荊子蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而大大的降低了游離態(tài)的蔓荊子油。因此，我們選擇了纖維素酶和木瓜蛋白酶為浸提蔓荊子油所用的酶。由圖1可以看出：?jiǎn)我坏氖褂媚竟系鞍酌负蛦我坏氖褂美w維素酶時(shí)，與混合酶（木瓜蛋白酶：纖維素酶=1：1）使用時(shí)，其得率都比混合酶的得率低。因?yàn)槔w維素酶對(duì)纖維素和半纖維素物質(zhì)會(huì)進(jìn)行酶解作用，同時(shí)，木瓜蛋白酶會(huì)使與蛋白結(jié)合的油脂分離開出，從而兩種酶的結(jié)合使用，使蔓荊子中結(jié)合態(tài)的油脂會(huì)游離出來，增加了正已烷溶劑的浸提效率。因此，我們選擇混合酶（木瓜蛋白酶：纖維素酶=1：1）為水酶結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油的過程當(dāng)中的酶添加方式。

2.2 料液比對(duì)蔓荊子油得率的影響

在不同料液比情況下測(cè)定并計(jì)算蔓荊子油得率。結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)蔓荊子油得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of viter rotundifolia oil

由圖2可知，在反應(yīng)體系中，料液比在1:4-1:6范圍內(nèi)，蔓荊子油的得率會(huì)隨著料液比的增加而提高，得率由2.38%(料液比1:4)增大到3.51%(料液比1:6)。當(dāng)料液比低于1:4時(shí)，加入的酶和底物蔓荊子粉末幾乎黏在一起，所加入的酶發(fā)揮不了作用。只有當(dāng)反應(yīng)體系中的料液比超過1:4后，加入的酶和底物蔓荊子粉末充分發(fā)生酶解作用，使蔓荊子細(xì)胞的細(xì)胞壁得到破壞，并且使得蔓荊子中與蛋白結(jié)合的油脂之間的作用力減小，因此，蔓荊子中大量的油脂被游離出來[8]。當(dāng)料液比達(dá)到當(dāng)料液比高于1：6時(shí)，蔓荊子油提取率反而下降，因?yàn)殡S著料液比的進(jìn)一步變大，酶作用底物的濃度卻開始下降，從而使酶解速率下降，導(dǎo)致蔓荊子油的提取率下降。從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定水酶法提取蔓荊子油的料液比為1:6。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)蔓荊子油得率的影響

在不同酶解時(shí)間情況下測(cè)定并計(jì)算蔓荊子油得率。結(jié)果見圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)蔓荊子油得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of viter rotundifolia oil

由圖3可知，酶解時(shí)間在1.0h到2.0h的范圍內(nèi)，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，所得到的蔓荊子油得率增加，當(dāng)酶解時(shí)間為1.0h時(shí)，所得的蔓荊子油得率為1.98%，當(dāng)酶解時(shí)間到達(dá)2.0h時(shí)，所得的蔓荊子油得率達(dá)到3.42%。但是，當(dāng)反應(yīng)體系中的酶解時(shí)間超過2h以后，蔓荊子油得率反而會(huì)略有下降，因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中游離出來的蔓荊子油會(huì)與一些蛋白質(zhì)和其他色素等雜質(zhì)相結(jié)合在一起，使蔓荊子油的得率會(huì)有所降低。因此，綜合考慮，選擇復(fù)合酶酶解時(shí)間為2h。

2.4 酶用量對(duì)蔓荊子油得率的影響

調(diào)節(jié)料液比為1:6，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為2h，酶用量分別為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，在不同酶用量情況下測(cè)定并計(jì)算蔓荊子油得率。結(jié)果見圖4。

圖4 酶用量對(duì)荊子油得率的影響Fig.4 Effect of dosage of enzyme on the yield of viter rotundifolia oil

從圖4.可看出，在加酶量在1.0%以內(nèi)，反應(yīng)體系中蔓荊子油的得率隨著加酶量的增多而逐漸增大。但當(dāng)反應(yīng)體系中的加酶量(E/S)超過1.0%之后，蔓荊子油的得率會(huì)有所增加，但其數(shù)值不明顯。因?yàn)樵诜磻?yīng)體系中，底物濃度已確定的情況下，反應(yīng)速率與酶濃度存在正比例關(guān)系，反應(yīng)體系中的酶解率會(huì)隨著加酶用量的增多而增加，當(dāng)反應(yīng)體系中的底物耗盡后，再增加酶的量時(shí)，蔓荊子油的得率也不再增加，因此，從生產(chǎn)成本上考慮，選擇最佳酶用量為1.0%。

2.5 工藝的優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)面分析法因素水平表及其分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取液料比、酶解溫度及酶用量對(duì)本試驗(yàn)有關(guān)的影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，具體見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table2 Levers and code of response surface experiments

表3 蔓荊子油響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3 Analysis and result of response surface experiments

設(shè)該模型通過最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)方程為：

式中：Y—預(yù)測(cè)響應(yīng)值；X0—常數(shù)項(xiàng)；X1、X2、X3—線性系數(shù)；X12、X13、X23—交互項(xiàng)系數(shù)；X11、X22、X33—二次項(xiàng)系數(shù)

表3為不同試驗(yàn)條件下所測(cè)定的蔓荊子油的得率，利用Design-expert 7.0 軟件對(duì)表3中蔓荊子油的各條件下的得率進(jìn)行多元回歸擬合，表4為回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，當(dāng) “Prob＞F” 值小于 0.05時(shí)，即表示該項(xiàng)指標(biāo)具有顯著性，可以用于蔓荊子油萃取試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。多項(xiàng)回歸方程為：

表4 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Regression coefficients and their significance

2.5.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的直觀分析

相應(yīng)曲面圖和等高線圖5所示。

圖5 y=f(x1，x2)的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot

由圖5可以看出：在固定兩個(gè)因素（水平值為0）水平值時(shí)，其他因素的3D曲面圖的總體形狀較相似，表現(xiàn)出的變化規(guī)律為這兩個(gè)因素均是隨另一個(gè)因素水平值的變化而先變大后減小，混合酶加入量因素的影響較為顯著。通過軟件 Design – Expert7.0求解方程，給出了最佳酶解工藝條件為：液料比8.4:1、酶解時(shí)間105h、酶用量1.1%，對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)3次，此時(shí)蔓荊子油的得率達(dá)到極值4.35%，與理論計(jì)算值誤差在0.5%左右。

[1]雷載權(quán).中藥學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2000，44.

[2]南京藥學(xué)院《中草藥學(xué)》編寫組.中草藥下冊(cè)[M].南京：江蘇科技出版社，1980：914.

[3]隋在云，王愛潔.蔓荊子解熱作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥藥理與臨床,2007,23(5) :138-139.

[4]Ikawati Z,Wahyuono S,Maeyama K.Screening if several Indonesian medicinal plants for their inhibitory effect on histaminere lease from RBL-2H3 cells[J].Ethnopharmacol,2001,75:249-256.

[5]Singh V,Dayal R,Bartley J P.Chemical constituents of Vitex negundo leaves [J].Med Arom Plant Sci,2003,25 (1) :94-98.

[6]Ono M,Yamamoto M,Masuoka C,et al.Diterpenes from the fruits of Vitex rotundifolia [J].Nat Prod,1999,62 (11) :1532-1527.

[7]陳奇,連曉媛,畢明,等.蔓荊子藥理作用研究[J].江西中醫(yī)藥,1991,2(1) :47-50.

[8]史素偉.酶法提取米糠油和蛋白及米糠油微膠囊化研究[D].南昌大學(xué)，2011.

Optimization for the extracting Viter rotundifolia oil by the combination of water and enzymes

Zeng Shan-rong1，Hu Ju-wu2
(1、Ganzhou Provincial Institute For Food And Drug Control,Jiangxi Ganzhou 334100；2、Institute of Applied Chemistry,Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330096)

The viter rotundifolia oil was extracted by the combination of water and enzymesfrom viter rotundifolia.The major influence factors such as solid-liquid ratio,Enzymatic hydrolysis time,dosage of enzyme were studied and analysised.By employing response surface methodology,the relationship of solid-liquid ratio,enzymatic hydrolysis time,dosage of enzyme was founded.The parameters of extraction process were optimized,so the optimal experiment parameters are:solid-liquid ratio 8.4:1,enzymatic hydrolysis time 105min,dosage of enzyme 1.1%.The method is high yield and high product purity and low pollution characteristics

viter rotundifolia;Response Surface Method

TS22

A

2096-0387（2017）05-0005-05

江西省科技支撐項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)201302417）。

曾善榮（1981-），男，工程師，研究方向：食品工程與檢測(cè)。