張鵬飛，丁楠，李萍＊

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川成都 610031）

花色素苷合成酶的生物信息學(xué)分析

張鵬飛，丁楠，李萍＊

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川成都 610031）

色素是一類水溶性的類黃酮物質(zhì)，是植物合成的一類次生代謝產(chǎn)物?；ㄉ睾铣缮婕耙幌盗械拇x反應(yīng)，花色素苷合成酶（anthocyanin synthesis，ANS）是其合成通路中末端的關(guān)鍵酶，能催化無色花色素轉(zhuǎn)化為有色花色素。目前對ANS的研究表明ANS的表達可調(diào)控花色素的積累以及果實和花的顏色。本課題采用生物信息學(xué)的方法，對已在 GenBank 上注冊的大丁草雜交品種等9種菊科植物ANS的氨基酸序列進行分析。通過此次研究，希望為今后深入研究該類酶的功能和結(jié)構(gòu)特征提供依據(jù)。

生物信息學(xué)；ANS；分子進化

花色和果色是植物重要的觀賞性狀，決定著花卉和果實的商品性和價值性[1]。在高等植物中類黃酮(flavonoid)、類胡蘿卜素(carotenoid)、和甜菜色素(anthocyanin)是使植物具有無窮魅力的內(nèi)在原因[2]，而類黃酮中的花色素更是對植物的成色至關(guān)重要?；ㄉ氐暮铣缮婕耙幌盗写x反應(yīng)，花色素苷的合成途徑中共有20種不同的有機分子參加反應(yīng)，涉及12種不同的催化酶，這些酶由多個同源的基因編碼，共同控制花色素苷合成途徑如圖1。其中有7種酶在途徑中起著較為重要的作用。其中一些酶對合成起到至關(guān)重要的作用[3-5]，而花色素苷合成酶（ANS）是花色素苷合成途徑后期的關(guān)鍵酶。

圖1 花色素苷生物合成途徑

ANS為無色花青素加氧酶，屬于2-酮戊二酸鐵依賴型雙加氧酶，最顯著的作用是催化無色花色素轉(zhuǎn)化為有色花色素，在花色素苷合成途徑的后期，ANS依賴2-酮戊二酸離子和Fe2+將無色的花色素氧化，產(chǎn)生有顏色的花色素[6]。ANS基因最先從玉米的突變體中通過轉(zhuǎn)座子標簽法分離得到，另外在擬南芥、圓葉牽牛、裂葉牽牛、洋桔梗、葡萄和銀杏中都有提取[7]。因此本課題在已有ANS研究的基礎(chǔ)上，收集9種菊科植物的ANS核苷酸序列和對應(yīng)的蛋白序列，分析它們的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能以及進化上的關(guān)系，以期為深入探究ANS的性質(zhì)和在植物生長活動中表現(xiàn)出的更廣泛作用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

數(shù)據(jù)從NCBI 搜索已注冊的ANS核苷酸序列及其對應(yīng)的氨基酸序，篩選出菊科（Asterales）部分序列作為研究材料，包括大丁草雜交品種（Gerbera hybrid cultivar，AAY15743.2）、 紫背菜（Gynura bicolor，BAJ17658.1）、大麗菊（Dahlia pinnata，BAJ21536.1）、瓜葉菊（Pericallis cruenta，ACF75869.2）、萵苣（Lactuca sativa，BAJ10383.1）、水母雪蓮花（Saussurea medusa，AAS48200.1）、翠菊（Callistephus chinensis，AAB66560.1）、茼蒿×杭白菊（Chrysanthemum x morifolium，ACF75873.2）、綠毛山柳菊（Hieracium pilosella，ACB56922.1）。

1.2 實驗方法

通過ProtParam 在線工具分析ANS基因的核酸序列和氨基酸序列的組成成分和理化性質(zhì)；通過SignalP[8]來檢測ANS基因的信號肽及其剪切位點；使用ProtScale[9]在線工具分析ANS基因的親疏水性；TMHMM[10]將預(yù)測序列中可能含有的跨膜結(jié)構(gòu)，NetNGlyc和NetPhos[11]分別分析序列中的糖基化和磷酸化位點；用MEGA做進化分析，進一步分析其進化關(guān)系；使用CDD[12]和SWISS-MODEL[13-15]用來預(yù)測ANS的保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，并與已知的ANS的結(jié)構(gòu)作比較。

2 實驗結(jié)果

2.1 ANS氨基酸序列理化性質(zhì)分析

用ProtParam在線工具對以上9中菊科植物ANS序列進行氨基酸理化性質(zhì)分析，結(jié)果如表1。

表1 ANS的氨基酸組成及理化性質(zhì)分析

由表1可知，九種菊科植物的花色素苷合成酶DNA序列長度、氨基酸數(shù)目、分子量、IP都表現(xiàn)出一致性，這是由遺傳的同源性所決定的。它們的序列長度在1 000bp-1 500bp之間；氨基酸總數(shù)均處在355bp左右；分子量均分布在40KD左右；IP值均低于6；Glu、Leu、Ile、Lys是所選菊科ANS序列共有的主要氨基酸，且9種菊科植物均不含Pyl、Sec；紫背菜、萵苣、水母雪蓮花和綠毛山柳菊蛋白為穩(wěn)定類蛋白，大丁草雜交品種、大麗菊、瓜葉菊、翠菊和茼蒿杭白菊為不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。

2.2 ANS核酸序列ORF預(yù)測

利用ORF Finder軟件查詢9種菊科植物ANS核酸序列的開放閱讀框（表2）。ORF Finder給出六組參考數(shù)據(jù)，來自于兩條鏈三聯(lián)體密碼子的不同閱讀順序，而真實結(jié)果只可能有一種。由于知道ANS蛋白序列長度，因此所示點開每一條ORF都對應(yīng)著編碼的蛋白質(zhì)的長度。結(jié)果表明9種植物ANS的開放閱讀框長度均在1 068bp左右，翠菊ORF偏長為1 276bp。這個結(jié)果在一定程度上體現(xiàn)了菊科植物ANS的保守性。

表2 9種菊科植物ANS核酸序列ORF預(yù)測和分析

2.3 信號肽的預(yù)測和分析

以綠毛山柳菊為研究對象，通過SignalP Server在線工具進行ANS氨基酸序列信號肽的分析。由圖2可知九種菊科植物的ANS蛋白序列均無信號肽。圖中所示綠色線和藍色線且值均較低，可以推測以上植物基因在游離核糖體上合成之后，新生成的蛋白質(zhì)并不進行轉(zhuǎn)運，而僅僅留在細胞質(zhì)凝膠中催化無色花色素干轉(zhuǎn)化成有色花色素苷從而推動花色素苷合成途徑進行。

圖2 綠毛山柳菊ANS氨基酸序列信號肽預(yù)測

2.4 親水性/疏水性的預(yù)測和分析

以綠毛山柳菊為例使用在線工具ProtScale（Hphob./ Kyte &Doolittle）預(yù)測結(jié)果如圖3，綠毛山柳菊ANS多肽鏈中第114位谷氨酸具有最低值-3.256，親水性最強；第189位亮氨酸具有最高值2.433，疏水性最強。就整條多肽鏈而言， 表現(xiàn)為親水性。通過對上述植物的分析可得到相近的結(jié)果。

圖3 綠毛山柳菊ANS氨基酸序列親/疏水性預(yù)測和分析

2.5 跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析

以綠毛山柳菊為研究對象，使用在線工具TMHMM Server進行了預(yù)測分析。如圖4，綠毛山柳菊的ANS氨基酸序列均在膜外，沒有穿插在膜之間的跨膜區(qū)，其他序列的一側(cè)結(jié)果亦是如此。這一結(jié)論與親水性預(yù)測結(jié)果一致，即所選ANS氨基酸序列均沒有跨膜結(jié)構(gòu)。我們可以推測，植物ANS蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)中合成后并不存在運輸，在合成部位或附近產(chǎn)生作用。還可以推測ANS不是分泌型蛋白質(zhì)。

圖4 綠毛山柳菊ANS氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.6 糖基化和磷酸化預(yù)測和分析

以綠毛山柳菊為例使用在線軟件NetNGlyc對ANS氨基酸序列進行糖基化分析。結(jié)果如圖5，在位置134的天冬酰胺處有藍色豎線，值為0.6 188，超過設(shè)定閥值0.5。便認為此處可能糖基化 。

圖5 綠毛山柳菊ANS氨基酸序列的糖基化預(yù)測

以綠毛山柳菊為研究對象，使用在線軟件Netphos分別預(yù)測了ANS氨基酸序列中的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸3種不同的磷酸化位點，如圖6。結(jié)果顯示，有許多豎線都超過閾值0.5，這些位點均有較大概率會被磷酸化。其中有8個絲氨酸磷酸化位點（為11、13、15、42、116、121、302和 324位）、5個蘇氨酸磷酸化位點（為7、158、163、182和322位）以及3個酪氨酸磷酸化位點（為144、167和285位）。

圖6 綠毛山柳菊ANS氨基酸序列的磷酸化預(yù)測

2.7 序列比對及進化樹的構(gòu)建

用MEGA軟件對所選菊科植物和一些不屬于菊科、但有同源性的植物如洋桔梗、番薯、裂葉牽牛、圓葉牽牛，這13種植物ANS氨基酸序列一同構(gòu)建進化樹，參數(shù)設(shè)置為自檢舉1 000次，模型選擇核苷酸p-distance，如圖7所示。

圖7 13種植物ANS氨基酸序列構(gòu)建的進化樹

上圖所示結(jié)果與分類學(xué)結(jié)論相符合，13條序列明顯被分為三大類，屬于桔梗科的洋桔梗自成一類，三種旋花科植物番薯、裂葉牽牛和圓葉牽牛被分成一類，9條菊科植物分成一類。同時菊科植物與旋花科植物親緣關(guān)系較近，菊科與桔?？浦参镉H緣關(guān)系相比之下較遠。被分出的旋花科植物中兩種牽牛（裂葉牽牛和圓葉牽牛）與另外一種植物番薯的親緣遠近從圖中也可以立刻看出。

2.8 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

以綠毛山柳菊為例使用在線軟件Swiss-Model對ANS氨基酸序列進行預(yù)測，結(jié)果如圖8所示，其二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)建是紅色的α-螺旋和綠色的無規(guī)則卷曲，其次是穿插在α螺旋和無規(guī)則卷曲中間的延伸鏈。9條序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果均與綠毛山柳菊相似，即他們二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，其次是延伸鏈。

圖8 綠毛山柳菊ANS氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析

2.9 保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析

以綠毛山柳菊為例使用在線軟件InterproScan分析ANS氨基酸序列，由圖9可知，綠毛山柳菊ANS氨基酸序列有一個20G-FeII_Oxy超家族。研究表明，ANS和F3H一樣同屬于一個氧化戊二酸依賴型加氧酶家族，InterproScan對于保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測剛好證明了這一結(jié)論。2-酮戊二酸-Fe+-雙加氧家族包含2 -酮戊二酸（2OG）和Fe（Ⅱ）依賴氧家族成員。這個家族包括脯4 -羥化酶α亞基C末端。全酶具有活性歐共體，催化反應(yīng)是：膠原L -脯氨酸+ 2-酮戊二酸+氧氣＜=＞膠原蛋白反式- 4 -羥基- L -脯氨酸+琥珀+二氧化碳。同時還有一個PLN03176 超家族，是cl14733家族的一員。

圖9 綠毛山柳菊ANS氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.10 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Swiss-Model對菊科植物ANS的氨基酸序列進行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果如圖10所顯示菊科植物ANS的空間三級結(jié)構(gòu)均有較大相同點，這與這些菊科核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列本身的相似性有關(guān)，同時如前所述菊科植物ANS蛋白中有較為保守的結(jié)構(gòu)域，決定著他們同屬于一個家族，三級結(jié)構(gòu)的相似性也證明此結(jié)論的準確性。

圖10 9種菊科植物ANS氨基酸序列三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 結(jié)論

本課題利用生物信息學(xué)的知識，利用網(wǎng)絡(luò)上豐富的軟件和信息資源，對9種菊科植物的ANS核苷酸和氨基酸序列進行預(yù)測。實驗結(jié)果表明，菊科植物ANS蛋白質(zhì)起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列長度分布在355bp左右，相差甚微；ANS蛋白質(zhì)偏酸性；ANS氨基酸序列所含氨基酸較保守，其中谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和賴氨酸在所有序列中均占有較高比例，同時全部不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸；ANS蛋白很可能僅僅停留在細胞質(zhì)中參與到花色素合成過程中，而不進行轉(zhuǎn)運等；ANS氨基酸序列糖基化分析發(fā)現(xiàn)不同植物ANS的糖基化位點不同個數(shù)也不同，推測正是由于分子水平糖基化不同，引起了二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)折疊和彎曲上的細微差異，但是能進行糖基化的位點只是位于天冬酰胺上，產(chǎn)生N-鏈接糖蛋白；ANS磷酸化分析看出序列上有很多磷酸化位點，而且出現(xiàn)的位置較統(tǒng)一；9種菊科植物ANS序列相似度極高，在氨基酸序列基礎(chǔ)上構(gòu)建的進化樹與形態(tài)學(xué)特征和物種分類標準基本吻合；菊科ANS氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)中含有的主要構(gòu)件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，其次是穿插在整個序列當中的延伸鏈；20G-FeII_Oxy超家族和PLN03176 超家族是他們共有的保守結(jié)構(gòu)域；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測通過彩色立體圖看出他們在結(jié)構(gòu)上具有極高的相似性。該研究結(jié)果可為深入開展ANS酶學(xué)特性的分子機理研究提供重要理論依據(jù)。

[1]李春雷,崔國新,許志茹,李玉花.植物二氫黃酮醇 4- 還原酶基因的研究進展.生物技術(shù)通訊,2009,20(3) :442-445.

[2]劉娟,馮群芳,張杰.二氫黃酮醇 4- 還原酶基因 (DFR) 與花色的修飾.植物生理學(xué)通訊,2005,41(6) :715- 719.

[3]Nakatsuka T,Nishihara M,Mishiba K,et al.Two different mutations are involved in the formation of white-flowered gentian plants.Plant Sci,2005,16(9):949-58．

[4]Weiss D,van der Luit AH,Kroon JTM,et al.Petunia homologue of the Antirrhinum majus candi and Zea mays A2 flavonoid genes;homology to flavanone 3-hydroxlase and ethylene-forming enzyme,Plant Mol Biol,1993,22(5):893-897．

[5]高愛紅,等.天然食用色素——花青素研究進展[J].保鮮與加工,2001,(3):25-27．

[6]Salisbury FB，Ross CW.Plant Physiology.California:Wads-worth Publishing Company.，1992.323～325．

[7]Xie D Y,Jackson L A,Cooper J D,Ferreira D,Paiva N L.Molecular and biochemical analysis of two cDNA clones encodingDihydrofla2 vonol242Reductase from M edicago truncatula.Plant Physiology,2004,13(4):979 - 994.

[8]Petersen T N,Brunak S,von Heijne G,et al.SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions [J].Nature methods,2011,8(10):785-786.

[9]Wilkins MR,Gasteiger E,Bairoch A,et al.Protein identification and analysis tools in the ExPASy server[J].Methods Mol Biol,1999,112:531-552.

[10]A Krogh,B Larsson,G von Heijne,et al.Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model:Application to complete genomes [J].Journal of Molecular Biology,2001,305 (3):567-580.

[11]Blom N,Gammeltoft S,Brunak S.Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites [J].J Mol Biol,1999,294(5):1351-1362.

[12]Marchler-Bauer A,ZhengC,Chitsaz F,et al.CDD:conserved domains and protein three-dimensional structure [J].Nucleic Acids Res,2013,41:348-352.

[13]Biasini M,Bienert S,Waterhouse A,et al.SWISS-MODEL:modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information[J].Nucleic acids research,2014.

[14]Kiefer F,Arnold K,Künzli M,et al.The SWISS MODEL Repository and associated resources [J].Nucleic Acids Research,2009,37:387-392.

[15]Guex N,Peitsch M C,Schwede T.Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer:A historical perspective[J].Electrophoresis,2009,30(S1):162-173.

Bioinformatics Analysis of Anthocyanin Synthesis in Plants

Zhang Peng-fei,Ding Nan,Li Ping*
（School of Life Science and Engineering,Southwest Jiaotong University,Sichuan Chengdu 610031）

Anthocyanin is a kind of water-soluble flavonoids,which is a class of secondary metabolites produced by plants.The procedure of anthocyanin synthesis involves a series of metabolic reactions,and the key enzyme ANS is just at the end of the pathway of anthocyanin synthesis that catalyzes the conversion of colorless anthocyanin pigment to the colored anthocyanin pigment.Current study of ANS shows that the expression of it can be a regulation factor to the accumulation of anthocyanin,and the controlling of color of fruits and flowers.This research project use the bioinformatics methods,analyze the amino acid sequence of 9 different gerbera hybrids that registered on GenBank .Through this research hope can provide evidence of functional and structural features of this kind of enzyme for further research.

Bioinformatics;ANS;Molecular evolutio

Q946

A

2096-0387（2017）05-0010-06

張鵬飛（1992—），男，甘肅隴西人，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

李萍（1962—），女，四川成都人，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。