俞海東，韓榮勛，羅靜波，許巧情，楊軍

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

小鼠胎兒與幼鼠腦蛋白的SDS-PAGE分析

俞海東，韓榮勛，羅靜波，許巧情，楊軍

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

采用SDS-PAGE凝膠電泳法，通過比較分析妊娠16.5d的鼠胎兒腦蛋白樣品及出生后7d幼鼠腦蛋白樣品的蛋白組成，研究了鼠大腦發(fā)育過程中出生前后腦蛋白質(zhì)組成的差異。分離后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色得到的電泳圖譜分析結(jié)果表明，采用8%的分離膠時觀察到4條電泳條帶存在差異，而采用15%的分離膠時則有2條電泳條帶存在差異。由此表明，在2個不同發(fā)育時期的樣品中共發(fā)現(xiàn)有6條蛋白質(zhì)條帶存在表達(dá)差異。

SDS-PAGE；妊娠16.5d；出生7d；腦蛋白；小鼠

蛋白質(zhì)在基因?qū)崿F(xiàn)其功能的過程中發(fā)揮著重要的作用。腦中蛋白質(zhì)占腦總重量的1/3左右，同時腦蛋白的研究也是蛋白質(zhì)研究中的一個重要領(lǐng)域。大腦的發(fā)育并不是出生后才開始的，在胎兒階段，大腦就在進(jìn)行著自己的發(fā)育過程。對出生后10、17、24d等不同腦發(fā)育期C57/BL6小鼠的研究表明，小鼠腦組織發(fā)育期間的細(xì)胞增生和分化與發(fā)育時期和腦組織區(qū)域相關(guān)[1]。目前國內(nèi)外對于蛋白質(zhì)的研究主要是集中于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究和特定蛋白質(zhì)的功能研究。因此，本研究采用SDS-PAGE分析方法對懷孕16.5d鼠胎兒和出生7d的幼鼠腦蛋白質(zhì)組成進(jìn)行了比較分析，從蛋白質(zhì)分子水平探索出生前后小鼠腦蛋白整體變化規(guī)律，以為研究小鼠大腦發(fā)育相關(guān)蛋白質(zhì)和找出大腦發(fā)育的關(guān)鍵蛋白質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1樣品的采集和準(zhǔn)備

用健康的4周齡以上小白鼠母鼠和公鼠，母鼠在下午腹腔注射5IU的PMSG 48h后再注射5IU的HCG。注射完HCG的小鼠以1∶1的公母比例合籠過夜。第二天早晨觀察母鼠是否有陰道栓存在，有陰道栓的母鼠即可認(rèn)為已懷孕并開始計(jì)算懷孕日期。之后在妊娠第16.5天和小鼠出生后第7天收集胎兒和幼鼠大腦作為實(shí)驗(yàn)樣品。

收集的腦組織用PBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS稱重，將0.1g腦組織放入玻璃勻漿器，加入1000μL裂解液(0.3%SDS、3%DTT、蛋白酶抑制劑、和0.5mol/LTris/HCl，pH8.0)充分混合后在低溫條件下對樣品進(jìn)行超聲波粉碎處理，再在室溫條件下反應(yīng)1h后在4℃、12000r/min條件下離心20min去除沉淀物。離心后取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用雙縮脲法測定蛋白濃度后分裝成每管60μg樣品并保存于-70℃冰箱中。

1.2SDS-PAGE分析

SDS-PAGE采用8%和15%分離膠[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40%(29∶1)Acry/Bis、蒸餾水、10% SDS、10% APS、TEMED]，本研究采用同等蛋白質(zhì)含量與同等樣品體積的上樣方法，上樣順序?yàn)镸arker、60μg出生7d后的幼鼠腦蛋白、60μg懷孕16.5d的小鼠胎兒腦蛋白。在100V電壓條件下進(jìn)行分離，實(shí)驗(yàn)所用Marker電泳后出現(xiàn)7條條帶，分子質(zhì)量分別為200、150、100、80、60、40ku。

電泳結(jié)束后取出凝膠，經(jīng)超純水漂洗后將凝膠放入固定液[30%(v/v)甲醇、10%(v/v)醋酸]中固定1h，然后取出凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色24h。染色結(jié)束后用脫色液(1%醋酸)脫色后進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果與分析

對相同蛋白質(zhì)質(zhì)量的懷孕16.5d的小鼠胎兒腦蛋白和出生7d的幼鼠腦蛋白，用8%、15%的分離膠在相同電泳條件下進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，所得的電泳圖譜見圖1和圖2。由圖1可以看出，在8%的分離膠中，分子質(zhì)量60ku以下的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品少1條；分子質(zhì)量40ku以上的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品少1條；分子質(zhì)量40ku以下的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品少1條；分子質(zhì)量30ku以下的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品多1條。而在15%的分離膠中可觀察到，分子質(zhì)量40ku以上的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品多1條；分子質(zhì)量30ku以下的條帶，在出生7d的樣品中沒有條帶，在懷孕16.5d的樣品中只有1條(圖2)。

3 討論與結(jié)論

在胎兒發(fā)育中，腦的發(fā)育是重要組成部分。胎兒期、圍產(chǎn)期、新生兒期，各種內(nèi)外環(huán)境的改變和各種因素都可能對發(fā)育中的腦造成影響[2]。小鼠大腦的發(fā)育過程大體上可以劃分為神經(jīng)管形成階段、神經(jīng)上皮-腦泡形成階段、神經(jīng)元遷移分化階段及神經(jīng)元成熟階段4個階段[3]。而小鼠腦蛋白的生成是從神經(jīng)管形成階段就開始的，因此對于小鼠腦蛋白的研究也必須從胎兒時期開始，這是系統(tǒng)性地研究小鼠腦部發(fā)育所必須的。在蛋白組學(xué)研究方面，已經(jīng)開展的腦蛋白質(zhì)組圖譜的繪制研究對象主要有人腦、鼠腦、人腦脊液、垂體等[4]。Tsugita等[5]對近交系C57BL/6小鼠大腦的1000余種蛋白進(jìn)行了功能上的分類，而在特定蛋白質(zhì)的功能研究領(lǐng)域方面，李波等[6]發(fā)現(xiàn)在小鼠腦發(fā)育過程中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78和GRP94與神經(jīng)細(xì)胞的分化和腦的形態(tài)建成有關(guān)，它們分別在腦發(fā)育的不同時期可能起著特異性地參與神經(jīng)細(xì)胞分化基因產(chǎn)物的折疊和翻譯調(diào)控作用。

而小鼠胎兒的腦形態(tài)在懷孕12.5d時初步建立，在后期的胚胎發(fā)育過程中，腦的組織形態(tài)進(jìn)一步完善，腦器官形態(tài)逐步成熟[7,8]。

為了探討出生前后小鼠腦蛋白整體變化規(guī)律及與大腦發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，本研究采用SDS-PAGE方法比較分析了懷孕16.5d和出生7d的小鼠腦的主要蛋白質(zhì)組成。結(jié)果表明在凝膠圖譜中兩者蛋白質(zhì)表達(dá)表現(xiàn)出了顯著差異。在8%的分離膠上進(jìn)行的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜上觀察到出生7d小鼠腦蛋白樣品與懷孕16.5d胎兒腦蛋白樣品有4條電泳條帶存在差異。在15%的分離膠上進(jìn)行的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜上觀察到出生7d小鼠腦蛋白樣品與懷孕16.5d胎兒腦蛋白樣品有2條電泳條帶存在差異。15%的分離膠由于較小的孔徑能把分子量較小含量豐富的酪蛋白分離開來，所以能看到高分子量蛋白質(zhì)組分分離后的條帶。

在此前與老化和發(fā)育相關(guān)的研究中，王靜等[9]采用雙向電泳方法分析了胚胎16d、出生后7d及出生后60d等3個發(fā)育時期的C57/Bl6雌性小鼠腦組織，并鑒定出8個蛋白點(diǎn)，其中α烯醇酶、磷蛋白質(zhì)P19及2個肌動蛋白在各發(fā)育階段均有穩(wěn)定表達(dá)，而C14orf166同源蛋白、28×103熱/酸穩(wěn)定的磷蛋白、3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶、40S核糖體蛋白S3a等4個蛋白隨年齡增大而豐度減低。之后，朱蕾[10]在采用雙向電泳方法分析的快速老化模型小鼠年齡增加過程中腦蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)，在海馬組織蛋白中有多個差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)存在。而在與疾病相關(guān)的腦蛋白研究中，謝妮等[11]在采用人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染小鼠腦組織前后的比較蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)顯著差異點(diǎn)36個，并鑒定出HCMV被膜蛋白pp65等6個蛋白。呂琳等[12]采用iTRAQ技術(shù)對弓形蟲慢性感染小鼠與健康小鼠的腦組織進(jìn)行蛋白組學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)了461個差異表達(dá)蛋白。

由于本研究采用的是比較簡便的SDS-PAGE法，所以只能觀察到不同時期蛋白條帶之間的差異，要了解表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)條帶的具體信息，需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定。本研究揭示了小鼠在胎兒及幼鼠階段的腦蛋白質(zhì)組成的差異，這對進(jìn)一步研究小鼠大腦發(fā)育相關(guān)蛋白質(zhì)并找出大腦發(fā)育的關(guān)鍵蛋白質(zhì)提供了基礎(chǔ)資料。

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2017-07-07

長江大學(xué)博士啟動基金項(xiàng)目(120/801200010128)。

俞海東(1978-)，女，講師，博士，主要從事蛋白質(zhì)的色譜分離與質(zhì)譜分析研究。通信作者：韓榮勛，hanrongxun@126.com。

[引著格式]俞海東，韓榮勛，羅靜波，等.小鼠胎兒與幼鼠腦蛋白的SDS-PAGE分析[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2017,14(18)：44～46.

S593+.2；Q959.837

A

1673-1409(2017)18-0044-03

[編輯] 余文斌