章俊

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

雷瓊，邱祖明

(湖北省荊州文物保護(hù)中心，湖北 荊州 434020)

范曉丹，汪儉，馬立安

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

江陵天星觀一號(hào)楚墓出土飽水木漆器F446中真菌對(duì)硬松木的腐蝕研究

章俊

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

雷瓊，邱祖明

(湖北省荊州文物保護(hù)中心，湖北 荊州 434020)

范曉丹，汪儉，馬立安

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

采用ITS序列分析方法對(duì)飽水木漆器F446(編號(hào)F)及其保存水環(huán)境(編號(hào)S)中的真菌進(jìn)行了鑒定，并選取典型菌按5×107個(gè)真菌孢子/瓶菌量接種馬尾松(Pinusmassoniana)心材(懸于無(wú)菌自來(lái)水中)，28℃培養(yǎng)300d，測(cè)試木材的損失率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從F中分離的真菌犁頭霉屬(Absidia)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其余真菌菌屬有曲霉屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)，S中真菌曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其余真菌菌屬為枝孢霉屬(Cladosporium)、青霉菌屬(Penicillium)及踝節(jié)霉菌屬(Talaromyces)。挑選從F和S中分離出的14株典型菌進(jìn)行木塊腐蝕試驗(yàn)，與對(duì)照組比較，其中有4株菌對(duì)馬尾松心材的腐蝕率差異達(dá)到極顯著(P<0.01)，2株菌對(duì)馬尾松心材的腐蝕率差異達(dá)到顯著(P<0.05)；這些真菌對(duì)馬尾松木材有一定的腐蝕作用，但是腐蝕率非常低，最高僅2.77%，表明這些真菌對(duì)試驗(yàn)?zāi)静鸟R尾松腐蝕并不嚴(yán)重。

飽水木漆器；ITS序列分析；木材腐蝕率；文物保護(hù)

我國(guó)木漆器歷史悠久，工藝精湛，不同時(shí)代有不同的風(fēng)格，具有很高的考古價(jià)值及觀賞價(jià)值。然而，木漆器出土以后，易干裂變形，主要還是保存在水池中[1,2]。文物木漆器在地下密封環(huán)境下，微生物代謝活動(dòng)幾乎停滯，對(duì)木漆器的腐蝕相對(duì)有限[3]，但是，文物出土以后，一旦環(huán)境適宜，微生物就會(huì)大量繁殖，山西翼城和長(zhǎng)沙譚家坡考古遺址都曾爆發(fā)過(guò)大規(guī)模真菌污染現(xiàn)象[4,5]。微生物對(duì)木質(zhì)文物有腐蝕作用，尤其是在環(huán)境條件適宜的情況下，有些真菌對(duì)木材有著很大的腐蝕率，甚至高達(dá)60%以上[6,7]。1978年，飽水木漆器F446出土于天星觀一號(hào)楚墓，保存在荊州博物館水池中近40a。本研究對(duì)文物木漆器F446樣品及其保存水環(huán)境樣品中分離的真菌進(jìn)行了鑒定，并模擬文物保存的水環(huán)境，評(píng)價(jià)了其對(duì)木材腐蝕性影響，并針對(duì)腐蝕性強(qiáng)的真菌，擬篩選殺菌抑菌劑，以期為延長(zhǎng)飽水木漆器的保存期提供生物學(xué)保護(hù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

菌株：試驗(yàn)菌株為木漆器F446(編號(hào)F)及保存水環(huán)境(編號(hào)S)中分離的真菌，保存于長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室[8]。根據(jù)菌落特征、菌絲和孢子結(jié)構(gòu)與形態(tài)，將F中分離的真菌初步分為5類，每類選取1株菌，編號(hào)分別為F-1～F-5；S中分離的真菌初步分為9類，每類選取1株菌，編號(hào)分別為S-1～S-9。

馬尾松：2根，購(gòu)自湖北省荊州市某木材市場(chǎng)。

試劑：ITS序列擴(kuò)增通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)[9]由上海生工生物(Sangon)公司合成，PCR所用試劑購(gòu)于北京鼎國(guó)生物公司。其他常用試劑，如CTAB、Tris-HCl、NaCl、EDTA、Tris飽和酚、氯仿和異戊醇等試劑為分析純或化學(xué)純。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基配制

PDA培養(yǎng)基主要成分：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉20g/L。按文獻(xiàn)[10]所述方法進(jìn)行配制。

1.2.2基因組DNA提取

將PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2d的真菌菌絲體以無(wú)菌刮鏟刮至預(yù)冷的研缽(-80℃過(guò)夜)中，快速研磨為粉末，裝入1.5mL EP管，并加入800μL 65℃預(yù)熱的CTAB緩沖液(2% CTAB，100mmol/L pH為8.0的Tris-HCl，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA)，65℃水浴30min；加入等體積的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，12000r/min離心5min，取上清液，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻，12000r/min離心5min，取上清液，加-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻并放置-20℃冰箱中30min；12000r/min離心10min，然后傾倒液體，并用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀(基因組DNA)2次，晾干后加入50μL ddH2O，4℃或-20℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3ITS序列分析

PCR反應(yīng)體積為50μL，其體系為5μL 10×Taq Buffer，5μL dNTPs(2mmol/L)，1μL Taq (2U/μL)，1μL上、下游引物(各10mmol/L)，33μL ddH2O，4μL基因組DNA模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。真菌ITS4和ITS5擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為500～700bp，合格的PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序。序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，單個(gè)靶區(qū)域序列比對(duì)真菌種屬鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11]，并采用MEGA6.0軟件進(jìn)行真菌菌群組成分析。

1.2.4測(cè)試菌對(duì)木材的腐蝕作用

按文獻(xiàn)[12]的方法選取馬尾松心材(邊部?jī)?nèi)側(cè)與髓心之間顏色較深部分)，切割成2cm×2cm×1cm小塊狀，裝入燒杯放入烘箱中(103±2)℃烘至恒重[13]，每次稱量前將木塊放入干燥器中冷卻。恒重后稱量10g左右的木塊分裝在規(guī)格相同的藍(lán)蓋螺紋廣口圓瓶中，121℃ 30min滅菌后冷卻備用[12,14]。將菌體接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7d，無(wú)菌水沖洗菌體后過(guò)濾收集菌孢子，并采用血球計(jì)數(shù)板顯微鏡下計(jì)數(shù)，每瓶接種孢子數(shù)目為5×107個(gè)，用無(wú)菌自來(lái)水定容至250mL，每菌株6個(gè)重復(fù)，并設(shè)不接菌對(duì)照組(CK)，28℃培養(yǎng)300d后，除去木塊表面真菌，烘干至恒重后測(cè)定木塊重量，計(jì)算木塊損失率[13]，并采用SPSS19.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1真菌的鑒定

真菌ITS4和ITS5擴(kuò)增片段比對(duì)結(jié)果如表1所示，結(jié)合圖1(真菌菌群組成圖)，將14株真菌鑒定為5個(gè)屬。其中，F(xiàn)中，犁頭霉屬(Absidia)為優(yōu)勢(shì)菌屬，占木材樣品真菌總數(shù)的69.2%；S中，曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢(shì)菌屬，占水樣真菌總數(shù)的61.1%。F-1和S-1為黃曲霉(Aspergillusflavus)，F(xiàn)-2和S-8為雜色曲霉(Aspergillusversicolor)，F(xiàn)-3為犁頭霉屬(Absidiasp.)，F(xiàn)-4和S-9為青霉菌屬(Penicilliumsp.)，F(xiàn)-5為煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)，S-2為枝孢霉屬(Cladosporiumsp.)，S-3為土曲霉(Aspergillusterreus)，S-4為菌核曲霉(Aspergillussclerotiorum)，S-5為Penicilliumgeorgiense，S-6和S-7為踝節(jié)霉菌屬(Talaromycessp.)的不同種。

表1 F446文物木漆器樣品及其水環(huán)境中真菌序列比對(duì)結(jié)果

圖1 F446文物木漆器樣品及其水環(huán)境中真菌菌群組成

2.2真菌對(duì)馬尾松心材的腐蝕

14株真菌對(duì)木材腐蝕試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。與對(duì)照組CK相比較，F(xiàn)-1(Aspergillusflavus)、F-5(Aspergillusfumigatus)、S-1(Aspergillusflavus)、S-2(Cladosporiumsp.)對(duì)馬尾松心材的腐蝕率較高，分別為2.77%、2.58%、2.57%和2.66%，達(dá)到極顯著性差異(P<0.01)；F-2(Aspergillusversicolor)和S-7(Talaromycessp.)對(duì)馬尾松心材的腐蝕率分別為2.56%和2.55%，達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，其余真菌對(duì)馬尾松心材無(wú)明顯的腐蝕作用(P>0.05)。

表2 真菌對(duì)馬尾松心材的平均損失率

注：**表示極顯著(P<0.01)，*表示顯著(P<0.05)，未標(biāo)注表示不顯著(P>0.05)。

3 討論與結(jié)論

本研究從F和S中分離的真菌共計(jì)5個(gè)屬，分別為曲霉屬(Aspergillus)、犁頭霉屬(Absidia)、踝節(jié)霉菌屬(Talaromyces)、青霉菌屬(Penicillium)和枝孢霉屬(Cladosporium)。F中，犁頭霉屬(Absidia)為優(yōu)勢(shì)菌屬，分離的菌株ITS序列相似度僅96%，可能為一個(gè)新種，且在其保存的水環(huán)境中未分離得到，說(shuō)明分離得到的犁頭霉屬可能來(lái)源于木漆器樣品而非保存環(huán)境。S中，曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢(shì)菌屬，還分離得到青霉菌屬(Penicillium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)和枝孢霉屬(Cladosporium)。青霉、曲霉是空氣中常見(jiàn)的微生物，在紙質(zhì)、紡織及竹木文物病害微生物調(diào)查中都曾發(fā)現(xiàn)[15～17]，由此可見(jiàn)，水樣中真菌可能主要來(lái)源于保存環(huán)境。

F和S中分離的真菌皆為霉菌。霉菌喜好潮濕環(huán)境，這也是荊州博物館暗室水槽中保存的文物木漆器F446(編號(hào)F)及保存水環(huán)境(S)真菌為霉菌的原因。但是，荊州博物館保存木漆器的水池深達(dá)1m左右，室溫常年保持較低水平，池水定期更換，可以有效控制文物木漆器保存環(huán)境中的霉菌的繁殖。所以，F(xiàn)和S中分離的真菌數(shù)目較少，分別為90CFU/g和5CFU/L[8]。通過(guò)對(duì)分離的真菌進(jìn)行腐蝕作用測(cè)定，發(fā)現(xiàn)曲霉屬(Aspergillus)、枝孢霉屬(Cladosporium)和踝節(jié)霉菌屬(Talaromyces)部分菌株對(duì)馬尾松心材存在腐蝕作用。霉菌主要生長(zhǎng)在木質(zhì)文物表面或近表面，但其菌絲也可沿木材紋孔侵入木質(zhì)文物內(nèi)部，通過(guò)分泌胞外酶分解一些復(fù)雜的有機(jī)物，如纖維素、幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)等，造成文物的破壞。田金英等[18]研究發(fā)現(xiàn)大量的霉菌對(duì)文物造成巨大的破壞，霉菌包括青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、木霉屬(Trichoderma)等多類霉菌，涉及的文物有書畫、絲織品、竹木、漆器、壁畫等。

本研究中真菌對(duì)馬尾松心材的損失率最大僅2.77%，屬于微損，且文物木漆器保存環(huán)境及其自身真菌數(shù)目均處于一個(gè)較低水平，說(shuō)明真菌對(duì)文物木漆器F446的腐蝕作用有限。但是，由于木漆器樣品及其水環(huán)境中存在的真菌主要類別為霉菌，霉菌易產(chǎn)生分生孢子，繁殖力極強(qiáng)，一旦條件適宜，短時(shí)間會(huì)快速爆發(fā)，存在著潛在風(fēng)險(xiǎn)，所以博物館對(duì)木器漆保存環(huán)境的控制不可松懈。

[1]李瀾.襄陽(yáng)文物考古研究所藏出土飽水木漆器保護(hù)與修復(fù)[J].中國(guó)生漆，2012，31(1)：9～12.

[2]張璐，姜曉光.吉林帽兒山飽水木質(zhì)文物的保護(hù)研究[J].博物館研究，2010，112(4)：84～89.

[3]陳家昌，黃霞，陳曉琳，等.出土飽水木質(zhì)文物的腐蝕病害類型與保護(hù)研究進(jìn)展[J].材料導(dǎo)報(bào)，2015，29(6)：96～128.

[4]武發(fā)思，蘇伯民，賀東鵬，等.山西翼城考古發(fā)掘現(xiàn)場(chǎng)遺址表面腐蝕真菌的群落組成分析[J].文物保護(hù)與考古科學(xué)，2012，24(3)：77～83.

[5]武發(fā)思，蘇伯民，賀東鵬，等.長(zhǎng)沙銅官窯譚家坡遺跡館內(nèi)優(yōu)勢(shì)病害真菌的分子鑒定[J].文物保護(hù)與考古科學(xué)，2014，26(4)：47～53.

[6]Jordan B A.Site characteristics impacting the survival of historic waterlogged wood:A review[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2001,47:47～54.

[7]周明，劉秀英，富巖.木材天然耐腐性室內(nèi)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法的研究[J].木材工業(yè)，1991，5(2)：29～32.

[8]范曉丹，雷瓊，邱祖明，等.江陵天星觀一號(hào)楚墓出土飽水木漆器微生物種類及數(shù)量調(diào)查[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2015，12(15)：51～53.

[9]王振華，張建坤，徐家文，等.草莓花枯病原真菌的PCR檢測(cè)[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，(9)：2052～2054.

[10]趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[11]王璇，李莉，王?，?，等.常見(jiàn)致病性真菌核糖體RNA基因分子鑒定[J].中華傳染病雜志，2013，31(3)：138～143.

[12]馬星霞，楊忠，蔣明亮，等.《木材天然耐腐性實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法》的修訂研究[J].木材工業(yè)，2009，23(3)：34～36.

[13]中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所，東北林業(yè)大學(xué).木材含水率測(cè)定方法(GB-T1931-2009)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[14]中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所，廣東省林業(yè)科學(xué)研究院.木材耐久性能第1部分：天然耐腐性實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法(GB/T13942.1-2009)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[15]閆麗，高雅，賈汀.古代書畫文物上污染霉菌的分離與鑒定研究[J].中國(guó)文物科學(xué)研究，2011，(1)：78～82.

[16]嚴(yán)淑梅.古代絲織品霉菌的微生物類群調(diào)查及其與保存現(xiàn)狀的關(guān)系[C].文物保護(hù)與修復(fù)紀(jì)實(shí)——第八屆全國(guó)考古與文物保護(hù)(化學(xué))學(xué)術(shù)會(huì)議論文集，2004.

[17]申艾君，王明道，劉康，等.館藏竹木漆器類文物污染霉菌類群的鑒定與分析[J].河南科學(xué)，2011，29(8)：923～926.

[18]田金英，王春蕾.霉菌對(duì)文物的影響初探[J].中國(guó)博物館，1999，(1)：82～86.

2017-04-14

出土木漆器保護(hù)國(guó)家文物局重點(diǎn)科研基地開放課題(33110016)。

章俊(1991-)，男，碩士生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物研究。通信作者：馬立安,malian@yangtzeu.edu.cn。

[引著格式]章俊,雷瓊，邱祖明,等.江陵天星觀一號(hào)楚墓出土飽水木漆器F446中真菌對(duì)硬松木的腐蝕研究J.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2017，14(18)：47～50，60.

Q939.98

A

1673-1409(2017)18-0047-04

[編輯] 余文斌