傅雁輝，聶 麗，夏 凡，舒群峰，魏賽金

?

松乳菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基研究

傅雁輝，聶 麗，夏 凡，舒群峰，魏賽金*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045）

選用松柏外生菌根真菌松乳菇（）為對(duì)象，研究該菌最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及培養(yǎng)基優(yōu)化。結(jié)果表明：松乳菇的最適碳源為蔗糖，菌絲干重為0.49 g；最優(yōu)氮源為蛋白胨，菌絲干重為0.68 g；MgSO4、維生素B1對(duì)菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯，其菌絲干重分別為0.42 g、0.48 g。二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)得出該菌最適培養(yǎng)基配方為蔗糖37.42 g/L、蛋白胨3.13 g/L，MgSO40.1 g/L，VB125 mg/L，pH為7。

松乳菇；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化；菌絲干重

松乳菇（)是一種紅菇科、乳菇屬的食用菌，又名美味松乳菇、雁來(lái)菌、松樹(shù)蘑，是一種深受大眾喜愛(ài)的美味野生食用菌[1]。松乳菇營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩，口味鮮美，具有抗菌抑制腫瘤等多種作用[2]。松乳菇的氨基酸含量遠(yuǎn)高于香菇，尤其是天冬氨酸和谷氨酸的含量較高，所以松乳菇具有很強(qiáng)烈的鮮味。從松乳菇中提取的多糖具有多種功效，如可以提高人體的免疫力、抑制菌體的生長(zhǎng)和抗癌等，其多糖提取物可以抑制肉瘤2180的生長(zhǎng)，對(duì)艾氏腹水癌同樣有抑制作用，其產(chǎn)生的乳菇紫素也具有抗菌的作用[3-4]。研究表明野生松乳菇子實(shí)體含有較高的Ga、Fe、Zn等人體所需的礦質(zhì)元素，但菌絲體中的礦質(zhì)元素的含量受培養(yǎng)基成分影響而有所差別，所以可以通過(guò)改變培養(yǎng)基的成分人為地調(diào)控松乳菇菌絲體中礦質(zhì)元素的含量[5]。松乳菇屬于菌根菌，一般與松柏等形成菌根，因其與植物共生，所以有著特殊的營(yíng)養(yǎng)方式和生活條件需求，因而目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有成功人工馴化栽培松乳菇[6]，市場(chǎng)上的供應(yīng)完全依賴(lài)野生采集，為了合理開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)這一珍貴的食用菌資源，人工培養(yǎng)松乳菇菌絲體取代子實(shí)體進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用是十分有效且便捷的方法[7]。

林親雄[8]、李靜[9]、廖曉初[10]、龍芳[11]等分別探索了碳源、氮源、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響，以確定適宜松乳菇菌絲生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基組成，但松乳菇菌絲生長(zhǎng)的條件因研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同和培養(yǎng)基的不同，最適值亦有所差異。鑒于此，試驗(yàn)從碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等方面對(duì)松乳菇搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行研究，尋找松乳菇菌絲生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株為松乳菇，由江西宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院惠贈(zèng)。MgSO4，KH2PO4、GuSO4和無(wú)水NaCO3、維生素B1、維生素B2、甘氨酸、麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、檸檬酸二胺等均為國(guó)產(chǎn)分析純；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸提液等均為國(guó)產(chǎn)生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

MP1002電子精密天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SPY50雙層培養(yǎng)搖床：上海市離心器械研究所；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2G雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，無(wú)水MgSO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，NH4Cl 2 g，KH2PO42 g，無(wú)水MgSO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。以上培養(yǎng)基均需121 ℃滅菌30 min備用。

1.3.2 松乳菇發(fā)酵培養(yǎng) 將PDA培養(yǎng)基上活化的松乳菇接種到液體種子培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h即得種子液。按接種量10%將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)2 d后每24 h取樣，每個(gè)處理重復(fù)3瓶。過(guò)濾獲得菌絲，80 ℃烘烤至恒重，測(cè)得菌絲生長(zhǎng)干重來(lái)確定不同組分對(duì)松乳菇生長(zhǎng)的影響。

1.3.3 碳源對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響 供試碳源有麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和糊精。使用相同質(zhì)量的不同碳源代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，測(cè)定菌絲干重。

1.3.4 氮源對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響 供試氮源有牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、檸檬酸二胺、酵母浸提液和草酸銨。使用相同質(zhì)量的不用氮源代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的NH4Cl，測(cè)定菌絲干重。

1.3.5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響 供試無(wú)機(jī)鹽有MgSO4，KH2PO4、CuSO4和無(wú)水NaCO3。用供試無(wú)機(jī)鹽代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的無(wú)水MgSO4和KH2PO4，供試水平為1 g/L，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定菌絲干重。

1.3.6 生長(zhǎng)因子對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響 供試生長(zhǎng)因子有維生素B1、維生素B2、甘氨酸和肌醇。將供試生長(zhǎng)因子加入到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，甘氨酸、肌醇在每100 mL培養(yǎng)基中加入0.5 mg，VB1、VB2加入2.5 mg，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基做空白對(duì)照，測(cè)定菌絲干重。

1.3.7 松乳菇最優(yōu)碳源、氮源二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn) 利用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以蔗糖30 g/L和蛋白胨3 g/L為零點(diǎn)，以10 g/L和1 g/L分別為蔗糖和蛋白胨的正負(fù)1區(qū)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，調(diào)整pH為7，每個(gè)處理做5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)5 d，測(cè)定菌絲干重。

表1 碳源和氮源的二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Originpro9.0畫(huà)圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌絲搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)的影響

由表2可知，松乳菇對(duì)供試的8種碳源均能利用，在不同碳源培養(yǎng)基中菌絲干重不同。且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，除糊精外，菌絲干重變化明顯，麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖培養(yǎng)基在發(fā)酵72 h菌絲干重達(dá)到最大值。在120 h時(shí)，以蔗糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)液中菌絲體干重最大，為0.49 g，因此蔗糖是松乳菇搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)碳源；菌絲干重最小的碳源為可溶性淀粉。

表2 不同碳源物質(zhì)對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響

表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(＜0.05)，下同。

圖1 不同氮源物質(zhì)對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2 氮源物質(zhì)對(duì)松乳菇菌絲搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，松乳菇對(duì)9種供試氮源都可以利用，但在不同氮源的培養(yǎng)基上菌絲體干重量差異顯著。方差分析表明，同一氮源不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵培養(yǎng)液中，松乳菇菌絲干重存在顯著差異。在120 h時(shí)，以蛋白胨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲干重最大，為0.68 g，因此蛋白胨是松乳菇搖瓶發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)的最優(yōu)氮源；其次為酵母膏，菌絲干重量為0.67 g；菌絲干重量最小的氮源為草酸銨，為0.08 g。

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)松乳菇菌絲搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)的影響

由表3可知，4種供試無(wú)機(jī)鹽對(duì)松乳菇菌絲體的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，加入不同無(wú)機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體干重不同，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲干重均有變化，其中培養(yǎng)96 h時(shí)，在加入MgSO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體干重最大為0.42 g；而且在含MgSO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中，從初期到發(fā)酵終點(diǎn)菌絲生長(zhǎng)一直都比較旺盛。因此MgSO4是松乳菇菌絲搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)最適無(wú)機(jī)鹽。

表3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 生長(zhǎng)因子對(duì)松乳菇菌絲搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，4種供試維生素對(duì)松乳菇菌絲體的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，但在加入不同維生素的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲干重不同，其中以加入維生素B1的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體干重最大，為0.48 g；其次為維生素B2，其菌絲干重量為0.47 g。

圖2 不同生長(zhǎng)因子對(duì)松乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.5 松乳菇搖瓶發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基的確定

不同營(yíng)養(yǎng)因子中碳源和氮源對(duì)松乳菇搖瓶發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)影響較大。以菌絲體生長(zhǎng)量為響應(yīng)值，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，回歸方程為：

=－0.261 6+0.012 871+0.099 812－0.000 129 112－0.009 6622－0.001 112。

由相應(yīng)數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果（表4）可以看出，回歸模型的<0.001，說(shuō)明回歸模型顯著，模型的擬合程度較好。從圖3中可以看出，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)（極大值）。通過(guò)計(jì)算，碳源及氮源的最佳濃度分別為1=37.421，2=3.131，此時(shí)菌絲體生長(zhǎng)量最大，達(dá)到0.128。

表4 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)方差分析

*** 表示差異極顯著（<0.001 0），** 表示差異極顯著（<0.01），* 表示差異顯著（<0.05）

圖3 松乳菇發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基響應(yīng)面圖

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

在松乳菇菌絲培養(yǎng)過(guò)程中，使用較多的碳源有葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、半乳糖、木糖、麥芽糖、乳糖、糊精、淀粉、玉米粉等[12-14]。對(duì)于哪種碳源更適于松乳菇生長(zhǎng)，分歧較大。研究表明，被認(rèn)為合適的碳源有葡萄糖[15]、麥芽糖[13-14]、蔗糖[12]、可溶性淀粉[8]等。本試驗(yàn)供試碳源中，最優(yōu)碳源是蔗糖，其促生效果是可溶性淀粉的3.5倍。與蘇菲婭等[16]、林親雄等[8]得到的最適碳源為可溶性淀粉的結(jié)果差異很大。松乳菇能利用的氮源較多，主要有蛋白胨、硝酸鉀、乙酸銨、硫酸銨、酒石酸銨、甘氨酸等。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，最適于松乳菇生長(zhǎng)的是蛋白胨，結(jié)果與林親雄等[8]、周傳云等[17]一致，但與廖曉初等[10]、周?chē)?guó)英等[12]研究結(jié)果不同。在實(shí)驗(yàn)中，以可溶性淀粉和乳糖為碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)量最低，可能與它們的溶解度和利用率有關(guān)，在以氨基酸和無(wú)機(jī)氮源的培養(yǎng)基上，松乳菇菌絲生長(zhǎng)較慢，因此松乳菇對(duì)有機(jī)復(fù)合氮源的利用更有優(yōu)勢(shì)。至于何種碳源、氮源更合適，應(yīng)與所用菌株或培養(yǎng)基有關(guān)，這有待于進(jìn)一步研究。4種供試無(wú)機(jī)鹽MgSO4、KH2PO4、CuSO4和無(wú)水NaCO3對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，其中MgSO4的促進(jìn)作用最大；4種供試生長(zhǎng)因子VB1、VB2、肌醇和甘氨酸對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，其中維生素B1的促進(jìn)作用最大。

3.2 結(jié) 論

搖瓶培養(yǎng)松乳菇的最適碳源為蔗糖，氮源為蛋白胨。MgSO4、維生素B1對(duì)菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯。結(jié)合二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，優(yōu)選的松乳菇搖瓶發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基配方是蔗糖37.42 g/L，蛋白胨3.13 g/L，MgSO40.1 g/L，維生素B125 mg/L，pH為7，培養(yǎng)溫度為28 ℃，該種搖瓶培養(yǎng)方法為加深松乳菇的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] 彭克儉. 松乳菇生物學(xué)特性初探[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, S1: 199.

[2] 柯麗霞. 松乳菇的抗菌活性研究[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版), 2002, 01: 63-64.

[3] 崔亮, 國(guó)興明, 劉麗. 野生松乳菇水溶性多糖提取工藝研究初報(bào)[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào), 2008, 27(6): 522-526.

[4] 陳楊瓊, 丁祥, 伍春蓮, 等. 松乳菇多糖抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2012, 19(3): 73-78.

[5] 敖常偉, 惠明, 李忠海, 等. 松乳菇營(yíng)養(yǎng)成分分析及松乳菇多糖的提取分離[J]. 食品工業(yè)科技, 2004, 24(9): 77-79.

[6] 熊濤, 肖滿(mǎn). 松乳菇研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(5): 84-86.

[7] 韓世明, 杜鵑, 夏海林. 松乳菇菌絲體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)需求及發(fā)酵條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(3): 224-226.

[8] 林親雄, 陳京元. 碳源和氮源對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2002, 9(1):44 -46.

[9] 李靜, 馬媛, 徐彥軍. 添加不同氮源對(duì)紫銅色松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 北方園藝, 2010(23): 171-173.

[10] 廖曉初, 李勇, 袁玲, 等. 氮源對(duì)松乳菇生長(zhǎng)及氮吸收和硝酸還原酶活性的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 28(3): 386-388.

[11] 龍芳, 張萬(wàn)萍. 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)食用菌, 2014, 33 (3): 27-30.

[12] 周?chē)?guó)英, 劉君昂, 李倩茹. 松乳菇菌種分離及菌絲生長(zhǎng)特性的研究[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 20(2): 158-161.

[13] 李磊, 羅桂祥, 陳明輝, 等. 松乳菇液體培養(yǎng)基的選擇及高生物量的獲得的研究[J].中國(guó)釀造, 2011(3): 77-81.

[14] 李靜, 馬媛, 徐彥軍, 等. 不同碳源對(duì)紫銅色松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響研究[J]. 中國(guó)食用菌, 2011, 30(1): 33-35.

[15] 吳連旺, 史寧, 陳璐, 等. 松乳菇的菌絲培養(yǎng)及人工栽培研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30(10): 233-236.

[16] 蘇菲婭, 辜夕容, 鄧雪梅, 等. 碳、氮和磷對(duì)松乳菇生長(zhǎng)及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015,41(5): 99-104.

[17] 周傳云, 廖興華, 譚周進(jìn), 等. 野生松乳菇菌種分離與培養(yǎng)特性的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(8): 66- 69.

Study on Liquid Fermentation Medium for the Cultivation of

FU Yan-hui, NIE Li, XIA Fan, SHU Qun-feng, WEI Sai-jin*

(Jiangxi Provincial Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

was selected as potential strain to study the optimum carbon, nitrogen source, inorganic salt, growth factor and optimization of culture conditions.The results showed that the optimal carbon source was sucrose and the dry mycelial weight of source was 0.49 g. The optimal nitrogen source waspeptone and the dry mycelial weight of peptone was 0.68 g. MgSO4and Vitamin B1played a most evident role in promoting the growth of mycelium, and the dry mycelial weight ofthem were 0.42 g and 0.48 g, respectively.In the quadratic orthogonal rotation design, the optimal carbon source and the optimal nitrogen source of the best medium were 37.42 g/L of sucrose, 3.13 g/L of peptone, MgSO40.1 g/L, VB125 mg/L, pH 7.

; fermentation medium; optimization; dry mycelial weight

S435.621

A

2095-3704（2017）03-0199-06

2017-08-30

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20133BBG70090)和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410410042）

傅雁輝，碩士研究生，主要從事微生物應(yīng)用研究，fyh8818@163.com；

*通信作者：魏賽金，女，教授，博士，主要從事微生物應(yīng)用研究，weisaijin@126.com。

傅雁輝, 聶麗, 夏凡, 等. 松乳菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基研究[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2017, 40(3): 199-204.