初洪波 車 燚 李海濤 謝曉燕

應(yīng)用高效液相法測(cè)定北五味子不同部位和不同炮制品中五味子醇甲的含量※

初洪波 車 燚 李海濤 謝曉燕*

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，長(zhǎng)春 130021）

目的 應(yīng)用高效液相法測(cè)定北五味子不同部位和不同炮制品中五味子醇甲的含量，探討五味子炮制時(shí)采用不同的方法對(duì)五味子醇甲含量的影響。方法 測(cè)定五味子醇甲含量時(shí)的流速為1.0 mL/min，色譜柱為島津WondaCract ODs-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；采用梯度洗脫的方法，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水。結(jié)果 原藥材（北五味子）、果肉、果核等不同部位中五味子醇甲含量為6.11 mg/g、4.23 mg/g、8.13 mg/g；未粉碎和粉碎的醋制炮制品中五味子醇甲含量為7.56 mg/g、7.73 mg/g，未粉碎和粉碎的酒蒸炮制品中五味子醇甲含量為含量為7.61 mg/g、7.82 mg/g。結(jié)論 醋制、酒蒸等不同的手段均可明顯提高炮制品中五味子醇甲含量，結(jié)合粉碎的方法可使五味子醇甲含量更高。關(guān)鍵詞：北五味子；五味子醇甲；炮制；含量測(cè)定

北五味子的主產(chǎn)地為長(zhǎng)白山地區(qū)，是吉林省道地藥材。斂肺滋腎、止瀉澀腸是其主要的功效， 收載于各家本草中，均列為上品。主要的臨床適應(yīng)癥為失眠、神經(jīng)衰弱、慢性肝炎和肺虛久咳等，具有解熱鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)咳的藥理作用，可明顯延長(zhǎng)睡眠時(shí)間。為了保證臨床效果，五味子需要經(jīng)過(guò)炮制，常見的炮制方法有醋制和酒蒸，其炮制品分別為醋五味子和酒蒸五味子[1]。北五味子藥典收載的功效物質(zhì)為五味子醇甲[2]，筆者對(duì)原藥材（北五味子）、果肉、果核及不同炮制品的功效成分進(jìn)行了測(cè)定，以期確定最佳的炮制工藝。本研究采用高效液相法建立了北五味子原藥材、果肉、果核及醋制品、酒蒸制品中五味子醇甲含量測(cè)定方法[3-16]。現(xiàn)就原藥材、果肉、果核及不同炮制品中功效物質(zhì)（五味子醇甲） 的含量比較研究報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相儀（島津LC-2010A型），Lab solution數(shù)據(jù)工作站，島津紫外檢測(cè)器， 電子分析天平（塞多利斯CP225D型，d=0.01mg），KQ-100型超聲波清洗器。

1.2 試劑和試藥 北五味子購(gòu)自長(zhǎng)春市璽康藥業(yè)，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院南敏倫教授鑒定，為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)。五味子醇甲（規(guī)格：20 mg，供含量測(cè)定用，批號(hào)：110857-201410，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇為色譜純；水為超純水；其它試劑皆為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 按表1中的比例采用梯度洗脫的方法，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。流速：1 mL/min，柱溫：室溫。色譜柱：填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠（4.6 mm×250 mm，5 μm）；五味子醇甲峰的理論板數(shù)應(yīng)≥3000[17]。

表1 梯度洗脫表

2.2 對(duì)照品溶液制備 取樣量：五味子醇甲約3 mg，精密稱定；制備容器和方法：置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[18]。

2.3 供試品溶液的制備 樣品取樣的要求：取通藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩） 約0.3 g，精密稱定； 制備容器和方法：置25 mL量瓶，加甲醇約18 mL，超聲處理30 min，超聲完成后，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得[19-20]。

2.4 五味子不同炮制方法樣品的制備[2]生五味子：除去雜質(zhì)和果柄，洗凈，干燥；五味子果肉、果核：取生五味子，用水潤(rùn)透，把果核、果肉分離，備用；醋制炮制品1:生五味子以比例 （米醋∶五味子=20∶100） 拌勻，悶潤(rùn)120 min，蒸制300 min，60℃干燥；醋制炮制品2：過(guò)20目篩原藥材粗粉，以比例（米醋∶五味子=20∶100） 拌勻，悶潤(rùn)120 min，蒸制300 min，60 ℃干燥；酒蒸炮制品1：生五味子以比例（黃酒∶五味子=20∶100） 拌勻，悶潤(rùn)120 min，蒸制300 min，60℃干燥；酒蒸炮制品2：過(guò)20目篩原藥材粗粉，以黃酒∶五味子=20∶100的比例加入黃酒拌勻，悶潤(rùn)120 min，蒸制300 min，60℃干燥。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性 五味子醇甲溶液、生五味子供試品溶液、溶劑（甲醇）各10 μL，精密吸取，注入液相色譜儀，目標(biāo)峰（五味子醇甲）與其它峰有較好的分離度，溶劑在相應(yīng)位置無(wú)干擾。方法專屬性良好。色譜圖見圖1～3。

圖1 對(duì)照品高效液相譜圖

圖2 生五味子供試品溶液高效液相譜圖

圖3 甲醇溶液譜圖

2.5.2 線性關(guān)系考察 對(duì)照品溶液2.0、5.0、8.0、10.0、15.0、20.0 μL，精密吸取，注入液相儀測(cè)定，橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量（μg），縱坐標(biāo)為峰面積積分值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4?；貧w方程：y=2070585.2471x+22107.8173，r=1.0000，五味子醇甲線性范圍為0.6200～6.2000 μg，試驗(yàn)結(jié)果見表2，對(duì)照品溶液進(jìn)樣量與峰面積的線性關(guān)系良好。

圖4 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 線性關(guān)系考察

2.5.3 耐用性試驗(yàn)

2.5.3.1 流速的考察 為了考察不同流速對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，我們選擇0.8 mL/min，1.0 mL/min，1.2 mL/min進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明其塔板數(shù)、分離度均達(dá)到要求。

2.3.3.2 柱溫考察 為了驗(yàn)證方法，考察柱溫的高低對(duì)色譜峰分離效果的影響，我們選擇20℃，25℃，30℃，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明其塔板數(shù)、分離度均達(dá)到要求。

2.5.3.3 不同色譜柱的考察 為了考察不同廠家的色譜柱對(duì)色譜峰分離度的影響，我們選擇不同品牌的色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明其塔板數(shù)、分離度均達(dá)到要求。

經(jīng)過(guò)對(duì)流速、柱溫和不同品牌色譜柱的考察試驗(yàn)，說(shuō)明試驗(yàn)條件的小變動(dòng)對(duì)我們?cè)O(shè)計(jì)的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)影響不大，所以我們選擇的方法有效。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 五味子醇甲對(duì)照品溶液10 μL，精密吸取，每隔一定時(shí)間注入液相色譜儀，考察方法的穩(wěn)定性（指標(biāo)為五味子醇甲峰面積積分值），結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示：RSD分別為0.06%，方法具有良好的穩(wěn)定性，即24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果可靠。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 五味子醇甲對(duì)照品溶液10 μL，精密吸取，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，記錄峰面積積分值，經(jīng)計(jì)算，精密度的結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗(yàn)

精密度考察結(jié)果顯示：RSD為0.47%，方法具有良好的精密度。

2.5.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 生五味子同一批樣品共6份，精密稱取，按供試品溶液項(xiàng)下方法制備，測(cè)定，計(jì)算，重現(xiàn)性的結(jié)果見表5。

表5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

以五味子醇甲為測(cè)定指標(biāo)，考察本法的重現(xiàn)性，RSD為0.94%，平均含量為6.11 mg/g，方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.5.7 中間精密度試驗(yàn) 生五味子同一批樣品共6份，精密稱取，按供試品溶液項(xiàng)下方法制備，由不同人員在不同時(shí)間依法獨(dú)立測(cè)定，計(jì)算樣品含量，以考察本法的中間精密度，結(jié)果見表6。

表6 中間精密度試驗(yàn)

中間精密度考察結(jié)果顯示：RSD分別為1.17%，方法具有良好中間精密度。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)樣品取樣的要求：含量為6.11mg/g的生五味子樣品（通過(guò)三號(hào)篩的粉末）約0.3 g，共6份，精密稱定；提取容器：25 mL量瓶；提取方法:分別精密加入濃度0.9 mg/mL五味子醇甲對(duì)照品溶液 (甲醇溶解)2 mL，分別精密加入甲醇約23 mL，超聲處理30 min。超聲完成后，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。測(cè)定，計(jì)算，試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 回收率試驗(yàn)結(jié)果

平均回收率為100.79%，RSD為1.41%，表明準(zhǔn)確性較好，方法可行。

2.5.9 含量測(cè)定 （1）制備原藥材、果肉和果核的供試品溶液，每批2份，對(duì)照品、供試品溶液各10 μL，精密吸取，注入液相色儀測(cè)定，不同樣品中五味子醇甲含量的結(jié)果見表8。

表8 生五味子、果肉和果核五味子醇甲含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

由五味子醇甲含量結(jié)果可知，果核中的含量明顯高于果肉中的。所以我們推測(cè)在炮制前對(duì)原藥材進(jìn)行粉碎，能提高炮制品中五味子醇甲含量，更好地保證炮制品的臨床療效。為了驗(yàn)證推測(cè)的正確性，我們進(jìn)行了下面的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

（2）制備酒蒸炮制品1、酒蒸炮制品2、醋制炮制品1、醋制炮制品2樣品的供試品溶液，每批2份，對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，分別精密吸取，注入液相色儀測(cè)定，計(jì)算，不同炮制方法樣品中五味子醇甲含量的結(jié)果見表9。

表9 不同炮制方法的五味子醇甲含量測(cè)定結(jié)果 （mg/g）

由炮制品中含量可知，無(wú)論是酒蒸還是醋制的方法都能明顯提高五味子醇甲含量。在炮制前對(duì)原藥材進(jìn)行粉碎，更能顯著地提高五味子醇甲含量。從藥材有效成分的角度確定五味子炮制的最佳工藝，是先把原藥材粉碎成20目粗粉，然后進(jìn)行酒蒸和醋制的炮制。

3 討論

參考《中國(guó)藥典》2015年版一部“五味子”項(xiàng)下收載，在保證五味子醇甲分離度好，選用梯度洗脫，使樣品中物質(zhì)盡快出峰。按此法操作，目標(biāo)物質(zhì)出峰的保留時(shí)間為15 min，具有良好的分離效果[21]。

取對(duì)照品溶液，在200～400 nm之間，使用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，測(cè)得250.12 nm為最大吸收波長(zhǎng)，與中國(guó)藥典2015年版一部“五味子”項(xiàng)下收載的檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm相符合，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm[22]。

筆者對(duì)五味子原藥材、果肉和果核炮制前后的五味子醇甲含量進(jìn)行了測(cè)定，以期從原藥材功效成分角度確定五味子炮制的最佳工藝。本試驗(yàn)通過(guò)比較五味子醇甲在原藥材、果核、果肉以及醋制炮制品、酒蒸炮制品中的含量差異，結(jié)果顯示，果核中五味子醇甲含量約為果肉的2倍。炮制前原藥材進(jìn)行粉碎，能夠顯著提高炮制品中五味子醇甲含量。因此，最終確定醋制五味子炮制品的最佳工藝為：過(guò)20目篩原藥材粗粉，以比例（米醋∶五味子=20∶100） 拌勻，悶潤(rùn)120 min，蒸制300 min，60℃干燥。酒蒸五味子炮制品的最佳工藝為：過(guò)20目篩原藥材粗粉，以黃酒∶五味子=20∶100的比例加入黃酒拌勻，悶潤(rùn)120 min，蒸制300 min，60℃干燥。

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Determination on the Content of Schisandrin in Different Processed Products and Different Parts of Schisandra Chinensis Fruits by High Performance Liquid Chromatography

CHU Hongongbo,CHE Yi,LI Haitao,XIE Xiaoyan*
(Traditional Chinese Medicine Research Center,the Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine,Jilin Province,Changchun 130021,China)

Objective Using high performance liquid chromatography to determine the content of Schisandrin in in different processed products and different parts of Schisandra Chinensis Fruits,and to discuss the influence of different processing methods on contents of Schisandrin.Methods The chromatographic column was Shimadzu WondaCract ODs-2,mobile phase A was methyl alcohol and water was mobile phase B,with gradient elution;detection wavelength of the UV detector:250nm.Results The contents of Schisandrin in Schisandra Chinensis Fruits,pulp and seeds were 6.11 mg/g,4.23 mg/g,and 8.13 mg/g.The contents of Schisandrin in wine steaming1,2 and vinegar steaming1,2 Schisandra Chinensis Fruits were 7.56 mg/g,7.73 mg/g,7.61 mg/g,7.82 mg/g.Conclusion The Schisandrin was increased significantly after being processed,which is processed after the pulverization.

Schisandra Chinensis Fruits;Schisandrin;process;content determination

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.20.064

1672-2779（2017）-20-0147-04

吉林省衛(wèi)生計(jì)生委自籌經(jīng)費(fèi)課題【No.2015ZFZ21】

*通訊作者：1194008581@qq.com

2017-06-20）