賴盼建 徐潔 李小兵 包云光

●論著

烏司他丁對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎新生大鼠小腸結(jié)腸的保護(hù)作用研究

賴盼建 徐潔 李小兵 包云光

目的探討烏司他丁對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)新生大鼠小腸結(jié)腸的保護(hù)作用。方法將60只3日齡SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、NEC模型組、烏司他丁治療組、烏司他丁對(duì)照組，每組15只。先采用綜合應(yīng)激法建模，即3日齡SD大鼠離開母鼠后，采用腸內(nèi)配方奶喂養(yǎng)、缺氧（100%CO2灌飼養(yǎng)箱10min）-高氧（97%O2灌飼養(yǎng)箱5min）暴露和冷應(yīng)激（4℃環(huán)境中5min）的方法，2次/d，連續(xù)3d，并加腹膜腔注射0.9%氯化鈉溶液。造模成功后取腸管組織切片，HE染色光鏡下觀察并作Shiou評(píng)分，免疫熒光法檢測(cè)自噬因子（Beclin-1）和自噬相關(guān)蛋白（LC3A/B）表達(dá)水平，Elisa法檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6水平。結(jié)果NEC模型組和正常對(duì)照組相比較炎癥反應(yīng)明顯改善，Shiou評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Beclin-1和LC3A/B熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。烏司他丁治療組和NEC模型組相比較炎癥反應(yīng)明顯改善，Shiou評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Beclin-1和LC3A/B水平可見熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著下降；TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論烏司他丁對(duì)NEC新生大鼠小腸結(jié)腸有保護(hù)與治療作用。

壞死性小腸結(jié)腸炎烏司他丁Shiou評(píng)分自噬與凋亡炎性因子

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）具有高發(fā)病率、病死率及致殘率的特點(diǎn)[1]。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，早產(chǎn)兒免疫功能及調(diào)節(jié)能力低下，缺血再灌注、氧自由基、感染等所誘導(dǎo)的異常炎癥反應(yīng)是共同損傷通路，最終導(dǎo)致胃腸道黏膜屏障功能障礙。烏司他丁為蛋白酶抑制劑（Ulinary trypsininhibitor，UTI），具有抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明烏司他丁能減少膿毒性休克動(dòng)物的死亡[3]，但目前關(guān)于是否能保護(hù)腸黏膜細(xì)胞的報(bào)道甚少。筆者采用人工喂養(yǎng)、缺氧和冷刺激建立新生大鼠NEC模型，研究烏司他丁對(duì)NEC所致的腸道炎癥、壞死和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，為探討NEC的發(fā)生機(jī)制，尋求有效預(yù)防和治療NEC的新策略提供依據(jù)。

（正文見第1735 頁(yè)）

圖1 各組大鼠腸道組織HE染色光鏡觀察（a：正常對(duì)照組；b：NEC模型組；c：烏司他丁治療組；d：烏司他丁對(duì)照組；HE染色，×200）

圖2 大鼠腸道組織Beclin-1熒光強(qiáng)度表達(dá)（a：正常對(duì)照組；b：NEC模型組；c：烏司他丁治療組；d：烏司他丁對(duì)照組；免疫熒光法，×400）

圖3 大鼠腸道組織LC3II熒光強(qiáng)度表達(dá)（a：正常對(duì)照組；b：NEC模型組；c：烏司他丁治療組；d：烏司他丁對(duì)照組；免疫熒光法，×400）

1 材料和方法

1.1 材料和儀器健康清潔級(jí)SD大鼠60只，雌雄不限，3日齡，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk（浙）20140001]，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)環(huán)境為浙江省金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物使用許可證號(hào)：syxk（浙）20140008]SPF動(dòng)物房。主要試劑：二甲苯（成都市科龍化工試劑廠）；伊紅（上海邁坤化工有限公司）；蘇木精（美國(guó)Sigma公司）；Beclin-1抗體、LC3抗體（英國(guó)Abcam公司）；驢抗兔二抗（Life Technology，激發(fā)/吸收波長(zhǎng)：488nm/525nm）；TNF-α Elisa試劑盒（武漢華美生物，貨號(hào)：CSB-E11987r）；IL-1β Elisa試劑盒（武漢華美生物，貨號(hào)：CSB-E08055r）；IL-6 Elisa試劑盒（武漢華美生物，貨號(hào)：CSB-E04640r）。主要儀器：輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2235型，德國(guó)LEICA公司）；病理組織漂烘儀（tec 2500型，常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司）；顯微鏡（BX43型，日本OLYMPUS公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；酶標(biāo)儀（BIO-RAD Model680）；洗板機(jī)（Mindray MW-12A）；恒溫箱（DHG-9140A型，揚(yáng)州鴻都電子）；高速離心機(jī)（Thermo ST16R）。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模將SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只：（1）正常對(duì)照組：常規(guī)喂養(yǎng)，不給予任何干預(yù)與刺激；（2）NEC模型組：離開母鼠后，采用腸內(nèi)配方奶喂養(yǎng)、缺氧-高氧暴露和冷應(yīng)激的方法，即新生大鼠在100%CO2中10min，4℃環(huán)境中5min，97%O2中5min，2次/d，連續(xù)3d，并在腹膜腔中注射0.9%氯化鈉注射液0.1ml；（3）烏司他丁治療組：在NEC模型成功基礎(chǔ)上，烏司他丁腹膜腔注射1次/d，劑量10 000U/（kg·d），連續(xù)3d；（4）烏司他丁對(duì)照組：新生大鼠離開母鼠后常規(guī)喂養(yǎng)，烏司他丁腹膜腔注射1次/d，劑量10000 U/（kg·d），連續(xù)3d。第7天，處死4組所有大鼠，取胃腸道組織（十二指腸末端至回盲部腸管）。

1.2.2 大鼠腸道組織HE染色病理學(xué)檢測(cè)取腸道頭端組織0.5cm，于4%甲醛溶液中固定3～5d，經(jīng)80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅲ進(jìn)行脫水處理，二甲苯2次各30min透明，浸蠟包埋，待蠟塊冷卻凝固后置于-20℃冷藏，行環(huán)狀切片（厚4μm）；常規(guī)HE染色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，紅細(xì)胞呈較鮮艷的紅色。腸道病理組織采用Shiou等[4]新的標(biāo)準(zhǔn)雙盲法評(píng)分，即0分：腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1分：輕微黏膜下和（或）固有層腫脹分離；2分：中度黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫；3分：重度黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫，局部絨毛脫落；4分：腸絨毛消失伴腸壞死。病理評(píng)分≥2分者視為NEC。

1.2.3 免疫熒光法檢測(cè)自噬與凋亡腸道組織常規(guī)切片；免疫熒光檢測(cè)大鼠小腸組織Beclin-1和LC3A/B的表達(dá)：（1）二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水；（2）抗原修復(fù)；（3）滴加一抗（Beclin-1抗體、LC3抗體），4℃孵育過(guò)夜，PBS水洗3×3min，并設(shè)PBS作為陰性對(duì)照；（4）滴加二抗（驢抗兔二抗），37℃孵育60min，PBS沖洗3×5min；（5）DAPI染核，室溫10min；（6）甘油PBS封片，熒光顯微鏡觀察。結(jié)果分析：綠色熒光所示為Beclin-1和LC3A/B，藍(lán)色為細(xì)胞核。

1.2.4 Elisa法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6水平使用前將所有試劑和樣本平衡至室溫；根據(jù)試劑盒說(shuō)明配制標(biāo)準(zhǔn)品；每孔依次加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，復(fù)孔，錫紙密封，37°孵育2h，吸棄孔內(nèi)液體，在干凈的紙上拍干；每孔依次加入100μl抗體，錫紙密封，37°孵育1h；使用洗板機(jī)洗滌，每孔洗滌液200μl，洗滌時(shí)間2min，總共洗滌3次；每孔依次加入100μl辣根過(guò)氧化物酶（HRP），錫紙密封，37°孵育1h；再次使用洗板機(jī)洗滌，每孔洗滌液200μl，洗滌時(shí)間2min，總共洗滌5次；每孔依次加入90μl四甲基聯(lián)苯胺（TMB）；錫紙密封，37°避光孵育30min；加終止液50μl，顯色；5min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450nm讀數(shù)，校正波長(zhǎng)540nm或570nm。計(jì)算結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值減去零標(biāo)準(zhǔn)的OD值，取2個(gè)復(fù)孔的均值；建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式，根據(jù)所測(cè)OD值計(jì)算出各樣本的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腸道組織HE染色病理學(xué)檢測(cè)各組大鼠腸道組織HE染色在光鏡下可見：正常對(duì)照組：腸黏膜上皮完整、連續(xù)，細(xì)胞與腺體排列規(guī)則，黏膜及黏膜下層無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；NEC模型組：腸絨毛水腫，黏膜固有層及黏膜下層大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（以中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主），腸腔毛細(xì)血管充血，甚至可見腸上皮壞死。烏司他丁治療組：腸黏膜上皮完整、連續(xù)，細(xì)胞與腺體排列規(guī)則，部分可見腸絨毛水腫和腸腔毛細(xì)血管充血，部分可見固有層少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；烏司他丁對(duì)照組：未見明顯炎癥性病變，見圖1（見插頁(yè)）。烏司他丁治療組和正常對(duì)照組及烏司他丁對(duì)照組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 腸道病理組織Shiou評(píng)分比較（分）

2.2 免疫熒光法定性檢測(cè)LC3II和Beclin 1的熒光強(qiáng)度相同曝光時(shí)間下，可見NEC模型組Beclin-1和LC3A/B熒光強(qiáng)度表達(dá)較其他3組強(qiáng)，烏司他丁治療組和正常對(duì)照組及烏司他丁對(duì)照組相比熒光強(qiáng)度未見差異。見圖2、3（見插頁(yè)）。

2.3 各組大鼠腸道組織炎性因子水平的比較給予烏司他丁治療的兩組炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著低于NEC模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠腸道組織炎性因子水平的比較

3 討論

目前NEC的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，其治療仍以對(duì)癥處理為主，療效不確切，急需尋求有效的防控措施。本研究采用人工喂養(yǎng)、缺氧和冷刺激建立新生大鼠NEC模型，探討NEC的發(fā)病可能機(jī)制，并尋求烏司他丁的干預(yù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏司他丁治療可明顯改善炎癥反應(yīng)，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯下降，Beclin-1和LC3A/B水平顯著下降；提示烏司他丁對(duì)NEC新生大鼠有保護(hù)與治療作用。

NEC腸道損傷機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮了重要作用。其中TNF-α、IL-1β及IL-6是重要的炎癥細(xì)胞因子，在全身性炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著主導(dǎo)作用，不僅可以引起其他細(xì)胞因子的釋放，而且可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附以及中性粒細(xì)胞的移行，釋放的炎癥介質(zhì)增加，進(jìn)一步加重組織臟器的損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與NEC組相比，烏司他丁干預(yù)組腸道組織炎癥反應(yīng)較輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，炎性因子TNF-、IL-1β、IL-6水平亦顯著下降，提示烏司他丁可通過(guò)抑制TNF-α等細(xì)胞因子和氧自由基產(chǎn)生，穩(wěn)定溶酶體和細(xì)胞膜及調(diào)控細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等而發(fā)生抑制炎癥反應(yīng)和保護(hù)腸黏膜屏障的作用[4-5]。臨床Meta分析顯示，烏司他丁抑制與心臟手術(shù)相關(guān)的TNF-α、IL-8、IL-等水平增加，支持本研究結(jié)果[6]。同樣，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證明，烏司他丁能顯著改善缺血再灌注及肺挫傷誘發(fā)的急性肺損傷中的炎癥和氧應(yīng)激[4-5]。但鮮見有關(guān)烏司他丁對(duì)NEC腸黏膜保護(hù)的相關(guān)研究，僅在燒傷或膿毒血癥研究中發(fā)現(xiàn)烏司他丁對(duì)小腸免疫屏障沒有直接的保護(hù)作用，但能有效降低血漿炎癥因子水平，可能改善炎癥抑制治療的效果[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，烏司他丁對(duì)NEC大鼠的炎癥抑制是有價(jià)值的，具有潛在治療效應(yīng)及應(yīng)用前景，需要更多研究以提供烏司他丁的作用機(jī)制及效果的證據(jù)。

細(xì)胞凋亡可能是最初腸黏膜細(xì)胞的主要死亡方式，已明確腸黏膜通透性增加是早產(chǎn)兒NEC發(fā)病的早期事件，且發(fā)現(xiàn)其過(guò)程存在細(xì)胞凋亡及自噬現(xiàn)象[8]。我們進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)，NEC模型組Beclin-1和LC3Ⅱ熒光強(qiáng)度表達(dá)較正常對(duì)照組及烏司他丁組強(qiáng)。提示烏司他丁可降低自噬與凋亡水平，從而表現(xiàn)出其腸道保護(hù)作用。細(xì)胞自噬與凋亡作為相互聯(lián)系的細(xì)胞過(guò)程，目前認(rèn)為具有相同的誘導(dǎo)、調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在NEC臨床病例與實(shí)驗(yàn)大鼠模型的回腸上皮細(xì)胞均有自噬的激活。自噬體由ATG12-Atg5的-Atg16復(fù)合體和微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3Ⅰ）-磷脂綴合物（LC3Ⅱ）介導(dǎo)形成[9]，因而LC3II被認(rèn)為是自噬的標(biāo)志。而Beclin-1為Ⅲ型PI3-激酶復(fù)合物的成分，參與自噬泡的成核過(guò)程，是另一種自噬標(biāo)記物[10]。另一方面，細(xì)胞凋亡可能是最初腸黏膜細(xì)胞的主要死亡方式，這種細(xì)胞凋亡作用可能是通過(guò)TNF-α等因子誘導(dǎo)線粒體功能障礙和激活線粒體凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在實(shí)驗(yàn)性NEC模型中證實(shí)，細(xì)胞自噬和凋亡均被活化，且細(xì)胞自噬先于細(xì)胞凋亡發(fā)生，繼而細(xì)胞凋亡后發(fā)生腸道組織的壞死，體外研究表明補(bǔ)充細(xì)胞生成素可顯著降低自噬和凋亡紅[8]。當(dāng)然，烏司他丁的保護(hù)腸上皮細(xì)胞作用是否通過(guò)免受過(guò)度自噬和細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)尚待進(jìn)一步的研究。

總之，烏司他丁可通過(guò)降低TNF-α、IL1-β、IL-6等炎癥介質(zhì)的表達(dá)來(lái)抑制腸道的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并能抑制腸黏膜上皮細(xì)胞的自噬與凋亡，對(duì)NEC新生大鼠腸損傷起保護(hù)作用。

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Protective effects of ulinastatin on necrotic enterocolitis in neonatal rats

LAI Panjian,XU Jie,LI Xiaobing,et al.

Department of Pediatrics,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the effects of ulinastatin on necrotic enterocolitis(NEC)in neonatal rats.Methods Sixty Sprague-Dawley rats aged of 3 days were randomly divided into four groups with 15 in each group:control,NEC model,NEC+Ulinastatin,and Ulinastatin.When experiments completed the intestinal samples were harvested and stained with hematoxylin and eosin(HE),the samples were observed under light microscope and scored according to the method of Shiou et al.Immun of luorescence was used to detect beclin-1 and LC3A/B to evaluate the autophagy and apoptosis.The inflammatory factors TNF-α,IL-1β,and IL-6 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsHE staining revealed that the inflammatory response in NEC+Ulinastatin group was significantly attenuated compared with that in the NEC model group.The pathological examination showed a significant difference in Shiou scores among 4 groups.The expression of beclin-1 and LC3A/B levels in intestinal tissue of NEC+Ulinastatin group were significantly decreased;and the levels of inflammatory factors TNF-α,IL-1β,and IL-6 were also significantly decreased(P＜0.05).Conclusion Ulinastatin exerted protective and therapeutic effects on NEC in neonatal rats.

Necrotizing enterocolitis Ulinastatin Shiou score Autophagy and apoptosis In flammatory factors

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.20.2017-770

浙江省科技計(jì)劃實(shí)驗(yàn)動(dòng)物項(xiàng)目（2014C37024）；金華市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015-3-010）

321000金華市中心醫(yī)院小兒科（賴盼建、徐潔、李小兵、包云光）

李小兵，E-mail：327283825@qq.com

2017-04-07）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）