孫陶利，戴智，蔣鵬程，吳柱，劉衛(wèi)平，卜振軍，唐靖，王建芬，馬寧#（1.長沙醫(yī)學院藥學院，長沙410219；2.新型藥物制劑研發(fā)湖南省重點實驗室培育基地，長沙410219；.湖南九典制藥股份有限公司，湖南瀏陽41029）

阿魏酸川芎嗪固體脂質(zhì)納米粒的處方優(yōu)化及質(zhì)量評價Δ

孫陶利1，2＊，戴智1，2，蔣鵬程1，2，吳柱1，2，劉衛(wèi)平1，2，卜振軍3，唐靖1，2，王建芬1，2，馬寧1，2#（1.長沙醫(yī)學院藥學院，長沙410219；2.新型藥物制劑研發(fā)湖南省重點實驗室培育基地，長沙410219；3.湖南九典制藥股份有限公司，湖南瀏陽410329）

目的：優(yōu)化阿魏酸川芎嗪（FATM）固體脂質(zhì)納米粒（FATM-SLN）的處方，并進行質(zhì)量評價。方法：采用乳化-超聲法制備FATM-SLN。以粒徑、包封率為指標，以單硬脂酸甘油酯、蛋黃卵磷脂（PC）、泊洛沙姆188（P188）、硬脂酸鈉用量為因素，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化FATM-SLN處方，并進行驗證試驗?？疾焖艶ATM-SLN的外觀形態(tài)、粒徑分布、Zeta電位、穩(wěn)定性和體外釋放度。結(jié)果：最優(yōu)處方為FATM 10 mg、單硬脂酸甘油酯300 mg、PC 200 mg、P188 200 mg、硬脂酸鈉10 mg、純化水20 mL。所制FATM-SLN呈類球形實體粒子，外觀形態(tài)較圓整，粒徑分布為40～800 nm，平均粒徑為106.23 nm，多分散系數(shù)為0.254，Zate電位為－34.8 mV，包封率為73.32%，載藥量為1.20%；4℃下10 d內(nèi)外觀無明顯變化（RSD＜2%）。其在0.5～1 h內(nèi)釋藥最快，1 h的累積釋放度達到60.47%；8 h后釋藥趨于平穩(wěn)，累積釋放度為93.46%，藥物基本釋放完全。結(jié)論：成功優(yōu)化FATM-SLN的處方；所制FATM-SLN的粒徑小、包封率高、穩(wěn)定性好。

阿魏酸川芎嗪；固體脂質(zhì)納米粒；處方優(yōu)化；正交試驗；粒徑分布；質(zhì)量評價

川芎嗪在臨床上主要用于缺血性腦血管疾病的治療，取得了較好的療效。但川芎嗪代謝快、半衰期短，應用時需頻繁給藥，易引起蓄積中毒[1-2]。阿魏酸具有抗血小板凝集、抑制血栓形成、保護心肌等藥理活性，在治療心、腦、腎等疾病方面效果較好，且毒副反應較低[3]。川芎嗪和阿魏酸的某些藥理作用一致，有研究發(fā)現(xiàn)，兩者配伍應用具有明顯的協(xié)同作用[4]。根據(jù)兩藥配伍使用的啟示，譚載友等[5-6]從傳統(tǒng)方劑補陽還五湯、血府逐瘀湯和十全大補湯中分別提取分離出了一種抗血小板凝集的化合物，其結(jié)構(gòu)包括阿魏酸和川芎嗪的主要結(jié)構(gòu)，故將其命名為阿魏酸川芎嗪（FATM）。隨后，大量研究證明，F(xiàn)ATM在抗血小板聚集、抑制血栓形成及在大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護方面，效果均優(yōu)于川芎嗪和阿魏酸，且毒副作用更低[6-8]。但目前關(guān)于FATM的研究主要集中在藥理活性及含量測定方面[7-9]，對其制劑的研究較少，主要是其普通制劑的研究。

固體脂質(zhì)納米粒（SLN）是20世紀90年代興起的一種新型藥物遞送劑型，是由多種類脂材料（如三酰甘油、豆磷脂等）形成的固體顆粒，具有物理穩(wěn)定性高、可控制藥物釋放、避免藥物降解或泄漏、靶向性良好、無毒等優(yōu)點[10]。與傳統(tǒng)的藥物制劑相比，將藥物包封在生理相容且耐受性好的SLN骨架中可提高藥物的生物利用度[11-13]。本研究擬采用乳化-超聲法制備FATM-SLN，并優(yōu)化其處方，以期為臨床提供物理穩(wěn)定性高、療效好、副作用小的新型FATM制劑。

1 材料

1.1 儀器

TG16臺式高速離心機（長沙英泰儀器有限公司）；Nano-ZS90激光粒徑測定儀（英國Malvan公司）；759S紫外-可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；LVEM5臺式透射電子顯微鏡（美國Delong公司）。

1.2 藥品與試劑

阿魏酸、川芎嗪原料藥（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：20160303、20160212，純度：98.1%、98.0%）；FATM（長沙醫(yī)學院藥學實驗室合成，批號：20160416，純度：98.0%）；甲醇（批號：20160223，色譜純）、磷酸（批號：20121114，優(yōu)級純）、蛋黃卵磷脂（PC，批號：20151222，分析純）、硬脂酸鈉（批號：20131209，分析純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；乙酸丁酯（江蘇強盛功能化學股份有限公司，批號：20120910，分析純）；單硬脂酸甘油酯（上海恒信化學試劑有限公司，批號：20130107，純度：95.0%）；泊洛沙姆188（P188，深圳市優(yōu)普惠股份有限公司，批號：WPWI625C，規(guī)格：F68，純度：98.5%）；葡聚糖凝膠G50（上海如吉生物有限公司，批號：20151112）。

2 方法與結(jié)果

2.1 FATM-SLN的制備

取處方量的FATM、PC、乙酸丁酯、單硬脂酸甘油酯，置于50 mL的燒杯中，70℃水浴使其溶解，作為油相；再取處方量的P188、硬脂酸鈉、純化水，置于20 mL燒杯中，70℃水浴使其溶解，作為水相；將油相注入水相中，70℃下5 000 r/min剪切5 min，探頭超聲（功率：30 kHz）5 min，迅速置于冰水浴中，冷卻至室溫，即得FATM-SLN。

2.2 FATM含量測定方法的建立

2.2.1 檢測波長的確定精密稱取FATM約0.010 2 g，置于50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，得FATM貯備液。精密移取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，以甲醇為空白對照，用紫外-可見分光光度計在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，F(xiàn)ATM最大吸收波長為320 nm，故確定320 nm為檢測波長。

2.2.2 輔料影響的考察取FATM-SLN 1 mL，用甲醇破乳并定容至25 mL，得供試品溶液。精密稱取FATM-SLN處方中所有輔料，制備成不含F(xiàn)ATM的空白SLN，作為陰性樣品；精密吸取陰性樣品1 mL，用甲醇破乳并定容至25 mL，即得空白溶液。將供試品溶液和空白溶液在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，輔料在320 nm波長處沒有吸收，對FATM的測定無干擾。

2.2.3 標準曲線的繪制精密稱取FATM 0.014 2 g，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為0.284 mg/mL的對照品貯備液。精密移取上述對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列質(zhì)量濃度對照品溶液。在320 nm波長處測定系列質(zhì)量濃度對照品溶液的吸光度值，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、吸光度值為縱坐標（y）繪制標淮曲線，得標準曲線方程為y＝0.075 01x－0.029 71（r＝0.999 4）。FATM檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為2.48～28.40μg/mL。

2.2.4 精密度試驗分別制備5.68、11.36、22.72μg/mL低、中、高3個質(zhì)量濃度的FATM-SLN甲醇溶液，在320 nm波長處測定其吸光度，各重復測定3次，考察精密度。計算得吸光度值的RSD分別為0.24%、0.94%、0.55%（n＝3），表明方法精密度良好，滿足測定要求。

2.2.5 準確度試驗按照處方量制備9份空白SLN，分別加入處方原料量80%、100%、120%的FATM，混勻，各平行制備3份。每個樣品吸取1 mL，用甲醇定容至25 mL，過濾。在320 nm波長處測定其吸光度，代入回歸方程計算其質(zhì)量濃度，并計算方法回收率。結(jié)果顯示，低、中、高水平樣品的平均方法回收率分別為98.9%、99.2%、101.1%，RSD分別為0.72%、1.11%、1.23%（n＝3），表明方法準確度良好，符合相關(guān)規(guī)定。

2.3 FATM-SLN包封率和載藥量的測定方法

本試驗采用葡聚糖凝膠柱色譜分離法根據(jù)分子篩原理分離游離FATM和FATM-SLN。操作如下：將葡聚糖凝膠G50用純化水充分溶脹，裝柱；吸取1 mL FATMSLN上柱，用蒸餾水洗脫，收集帶有乳光部分的洗脫液（FATM-SLN）；吸取0.5 mL該部分洗脫液，加甲醇至25 mL進行破乳；另吸取0.5 mL FATM-SLN直接用甲醇破乳并定容至25 mL量瓶中；在320 nm波長處測定吸光度，代入回歸方程計算FATM含量，按公式計算包封率和載藥量。包封率（%）＝c柱/c總×100%，式中c柱為FATM-SLN通過葡聚糖凝膠后的藥物量，c總為FATMSLN的總量；載藥量（%）＝c包/c加×100%，式中c包為被包封的藥物量，c加為處方中加入的藥物總量。

2.4 處方研究與工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗通過單因素試驗分別考察不同用量單硬脂酸甘油酯（300、400、500、600、700 mg）、PC（400、500、600、700、800 mg）、P188（400、500、600、700、800 mg）、硬脂酸鈉（10、20、30、40、50 mg）對FATM-SLN包封率和粒徑的影響。結(jié)果顯示，單硬脂酸甘油酯用量越大，包封率越?。ㄒ来螢?9.8%、66.2%、53.1%、40.1%、35.5%），粒徑越大（依次為89.1、98.3、125.1、143.5、188.4 nm），故確定其用量應小于400 mg；PC用量越大，包封率越?。ㄒ来螢?7.2%、57.2%、45.8%、34.8%、33.4%），粒徑越大（依次為93.2、137.4、166.4、193.5、198.5 nm），故確定其用量應小于400 mg；P188對包封率的影響不大，但對粒徑有一定影響，粒徑依次為96.8、93.2、104.0、108.8、125.3 nm，故確定其用量應小于500 mg；硬脂酸鈉用量對包封率和粒徑均有一定的影響，當硬脂酸鈉的用量大于40 mg時，包封率會降至60%以下，粒徑會增大至170 nm以上，故確定其用量在10～30 mg范圍內(nèi)為宜。

2.4.2 正交試驗單因素試驗結(jié)果顯示，單硬脂酸甘油酯、PC、P188、硬脂酸鈉中任意一種輔料用量的增大都會引起FATM-SLN粒徑的增大，因此應在不影響FATMSLN包封率的情況下盡量減少上述4種材料的用量。按照正交設(shè)計法，選擇4因素[單硬脂酸甘油酯用量（A，mg）、PC用量（B，mg）、P188用量（C，mg）、硬脂酸鈉用量（D，mg）]3水平，按L9（34）表設(shè)計試驗，以包封率為指標優(yōu)化處方。因素與水平見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab1 Factors and levels

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab2 Orthogonal test design and results

表3 方差分析結(jié)果Tab3 Results of variance analysis

由表2和表3結(jié)果可知，各因素對FATM-SLN包封率影響程度依次為D＞A＞C＞B，A、C、D對包封率有顯著影響（P＜0.05），而B對包封率無顯著影響（P＞0.05）。綜合考慮，最終選擇A2B1C1D1為最優(yōu)處方，即單硬脂酸甘油酯（脂質(zhì)材料）300 mg、PC 200 mg、P188 200 mg、硬脂酸鈉10 mg。

2.4.3 驗證試驗以最優(yōu)處方制備3批FATM-SLN，測定3批樣品的粒徑、包封率、載藥量。結(jié)果顯示，3批樣品的粒徑分別為107.60、106.10、105.00 nm，平均值為106.23 nm，RSD為1.30%；包封率分別為71.46%、73.33%、75.16%，平均值為13.32%，RSD為1.85%；載藥量分別為1.15%、1.19%、1.27%，平均值為1.20%，RSD為0.09%。根據(jù)包封率測定方法測定FATM-SLN樣品中FATM的平均含量為0.35 mg/mL（RSD為1.88%，n＝3）。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗將FATM-SLN置于25℃和4℃環(huán)境中放置10 d，考察溫度對FATM-SLN穩(wěn)定性的影響。結(jié)果，放置在25℃下的3批樣品出現(xiàn)不同程度的白色絮狀物，吸光度的RSD＞3%；放置在4℃下的樣品外觀無明顯變化，吸光度的RSD＜2%，表明樣品在4℃下放置10 d基本穩(wěn)定。

2.4.5 外觀形態(tài)、粒徑分布及Zeta電位利用透射電子顯微鏡觀察FATM-SLN的表面形態(tài)。將FATM-SLN加超純水稀釋10倍，取適量滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，用1%磷鎢酸染色，室溫放置至形成薄膜后用透射電子顯微鏡觀察。結(jié)果其形態(tài)為類球形實體粒子，外觀形態(tài)較圓整，粒徑在40～800 nm范圍內(nèi)。吸取一定量的FATMSLN，加超純水稀釋10倍，用激光粒徑測定儀測定其粒徑及電位。結(jié)果，其平均粒徑為106.23 nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.254，Zeta電位為－34.8 mV。FATM-SLN的透射電鏡圖見圖1，粒徑分布及Zeta電位圖見圖2。

圖1 FATM-SLN的透射電子顯微鏡圖（×300 000）Fig1 Transmission electron micrograph of FATM-SLN（×300 000）

圖2 FATM-SLN的粒徑分布及Zeta電位圖Fig2 Particle size distribution and Zeta potential diagram of FATM-SLN

2.4.6 體外釋藥考察精密吸取1 mL FATM-SLN溶液，放入透析袋中，再加入5 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），并置于含44 mL PBS的100 mL廣口瓶中，37℃恒溫水浴。分別放置0.5、0.75、1、2、4、8、12 h，按時分別取透析溶液3 mL（取液同時向廣口瓶中補加3 mL新鮮介質(zhì)），過濾后通過測定其中FATM含量，計算累積釋放度。結(jié)果顯示，F(xiàn)ATM-SLN在0.5～1 h內(nèi)釋放最快，1 h的累積釋放度達到60.47%；8 h后趨于平穩(wěn)，8 h的累積釋放度為93.46%，藥物基本釋放完全。FATM-SLN的體外釋放曲線見圖3。

3 討論

制備納米粒的材料較多，大致可分為脂質(zhì)材料和聚合物，前者制成的納米粒稱為固體脂質(zhì)納米粒，后者稱為聚合物納米粒。由于大部分聚合物納米粒在體內(nèi)降解后有一定的毒性[14]，所以本研究選擇具有可控制藥物釋放、生理相容性及靶向性良好的單硬脂酸甘油酯和乙酸丁酯為復合脂質(zhì)材料，兩者復合使用所得納米粒粒徑小、穩(wěn)定性高。表面活性劑選用PC、P188、硬脂酸鈉，PC為天然乳化劑，屬于動物磷脂，具有更好的生物活性和人體利用率；P188為非離子表面活性劑，是常用的供注射用的合成乳化劑；硬脂酸鈉為陰離子表面活性劑，具有優(yōu)良的乳化能力，與非離子表面活性劑聯(lián)合使用，臨界膠束濃度更低、乳化效果更強。復配乳化劑可有效降低納米粒的粒徑、提高穩(wěn)定性，因此本研究選用PC、P188、硬脂酸鈉為復配乳化劑。

FATM-SLN的制備受到許多因素如復合脂質(zhì)材料的混合比、攪拌時間、勻質(zhì)壓力、超聲功率等影響。本研究處方的篩選分為兩步，第一步：以單因素試驗篩選影響FATM-SLN包封率和粒徑的因素；第二步：以包封率為考察指標設(shè)計正交試驗，進一步優(yōu)選處方，篩選出FATM-SLN的最優(yōu)處方，再進行一系列的質(zhì)量評價。結(jié)果表明，本處方制備的FATM-SLN物理穩(wěn)定性良好，包封率＞70%，為FATM制成的長循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒（FATM-LCN）注射用凍干制劑及為臨床提供物理穩(wěn)定性高、療效好、副作用小的新型FATM制劑奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

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Formulation Optimization and Quality Evaluation of Ferulic Acid Ligustrazine Solid Lipid Nanoparticles

SUN Taoli1，2，DAI Zhi1，2，JIANG Pengcheng1，2，WU Zhu1，2，LIU Weiping1，2，BU Zhenjun3，TANG Jing1，2，WANG Jianfen1，2，MA Ning1，2（1.School of Pharmacy，Changsha Medical University，Changsha 410219，China；2.Key Laboratory Breeding Base of Hunan Oriented Fundamental and Applied Research of Innovative Pharmaceutics，Changsha 410219，China；3.Hunan Jiudian Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hunan Liuyang 410329，China）

OBJECTIVE：To optimize the formulation of ferulic acid ligustrazine（FATM）solid lipid nanoparticles（FATM-SLN），and conduct the quality evaluation.METHODS：Emulsification ultrasonic method was used to prepare FATM-SLN.Using particle size and entrapment efficiency as indexes，amount of glyceryl monostearate，egg yolk lecithin（PC），poloxamer 188（P188），and sodium stearate as factors，single factor test and orthogonal test were used to optimize the formulation；and verification test was conducted.The appearance morphology，distribution of particle size，Zeta potential，stability and in vitro release degree of prepared FATM-SLN were investigated.RESULTS：The optimal formulation was as follows as FATM of 10 mg，glyceryl monostearate of 300 mg，PC of 200 mg，P188 of 200 mg，sodium stearate of 10 mg，and purified water of 20 mL.The prepared FATM-SLN showed spherical solid particles，appearance morphology was round，distribution of particle size was 40-800 nm，particle size was 106.23 nm，polydispersity index was 0.254，Zeta potential was－34.8 mV，entrapment efficiency was 73.32%，drug loading was 1.20%；the appearance had no obvious changes within 10 d in 4℃（RSD＜2%）.The drug-release in 0.5-1 h was the fastest，the cumulative release degree reached to 60.47%；it tended to be stable after 8 h，the cumulative release degree reached to 93.46%，and drugs were basically released completely.CONCLUSIONS：FATM-SLN formulation is successfully optimized，and the prepared FATM-SLN has small particle size，high entrapment efficiency and good stability.

Ferulic acid ligustrazine；Solid lipid nanoparticles；Formulation optimization；Orthogonal test；Distribution of particle size；Quality eraluation

R943

A

1001-0408（2017）31-4434-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.29

湖南省教育廳高?？蒲袑ｍ棧∟o.15A025）；湖南省重點研發(fā)計劃、創(chuàng)新平臺與人才計劃項目（No.湘科規(guī)材〔2016〕8號）；湖南省高?？蒲许椖浚∟o.湘教通〔2012〕596號）

＊講師，碩士。研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)。電話：0731-88602853。E-mail：taoli198803@126.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：藥物新劑型、藥動學。電話：0731-88602646。E-mail：761472615@qq.com

2016-12-15

2017-03-13）

（編輯：鄒麗娟）