吳銘芳，許文佳，祖元?jiǎng)?，趙修華（東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

樺木酸納米粒的制備與表征

吳銘芳＊，許文佳，祖元?jiǎng)?，趙修華#（東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

目的：制備樺木酸納米粒，并對(duì)其進(jìn)行表征。方法：以乙醇為溶劑、水為反溶劑，采用反溶劑重結(jié)晶法制備樺木酸納米粒。以粒徑為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化樺木酸納米粒處方工藝中樺木酸溶液質(zhì)量濃度、反溶劑-溶劑體積比、反溶劑滴加速度、反應(yīng)溫度和攪拌速度，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。采用掃描電子顯微鏡、激光粒度儀、傅里葉紅外光譜儀和質(zhì)譜分析儀對(duì)所制得的樺木酸納米粒進(jìn)行表征。結(jié)果：最優(yōu)處方工藝為樺木酸溶液質(zhì)量濃度為3 mg/mL、反溶劑-溶劑體積比為1∶1、反溶劑滴加速度為8 mL/min、反應(yīng)溫度為20℃、攪拌速度為900 r/min；所制樺木酸納米混懸液粒徑為（156.0±8.6）nm（n＝3），凍干后粒徑為（235.0±12.2）nm（n＝3），外觀近球形、大小均勻、形態(tài)較規(guī)整；與樺木酸原料藥比較，所制樺木酸納米粒的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，分子量和質(zhì)荷比無明顯變化。結(jié)論：成功制得樺木酸納米粒。

樺木酸；納米粒；反溶劑重結(jié)晶法；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)；表征

樺木酸（Betulinic acid）又稱白樺酯酸，是從白樺樹皮中萃取得到的一種五環(huán)三萜類化合物，具有抗腫瘤[1]、抗人類免疫缺陷病毒[2]、抗炎[3-4]和抗瘧病[5]等藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)，樺木酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和對(duì)抗血管新生，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)癌細(xì)胞具有靶向作用，且毒性很小，是最有前途的抗癌藥物前體之一。但由于樺木酸水溶性差、口服生物利用度低[6]，其應(yīng)用受到了限制。為了提高難溶性藥物的生物利用度，可將其制備成粒徑小、粒度分布均勻的納米粒。藥物納米化的常用方法有氣流粉碎法、機(jī)械粉碎法、高壓均質(zhì)技術(shù)、超臨界流體技術(shù)和反溶劑重結(jié)晶法等。目前應(yīng)用最廣泛的是機(jī)械粉碎法，但是其缺點(diǎn)是耗能大、效率低和所制納米粒粒徑分布不均勻；而高壓均質(zhì)技術(shù)[7]和超臨界流體技術(shù)[8]又都存在高投資、低產(chǎn)率等缺點(diǎn)。

反溶劑重結(jié)晶法是把藥物溶于溶劑中后，再加入反溶劑中，通過降低溶劑的溶解能力，使藥物迅速達(dá)到過飽和狀態(tài)而析出結(jié)晶的一種傳統(tǒng)微粉化技術(shù)[9]。此方法具有易操作、成本低及能夠適應(yīng)工業(yè)化大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，通過該法已成功制備了多種難溶性口服藥物納米粒[10]。本研究擬通過反溶劑重結(jié)晶法制備樺木酸納米粒并對(duì)其進(jìn)行表征，以期提高樺木酸的口服生物利用度。

1 材料

1.1 儀器

BI-200SM型Zeta電位及粒度分析儀（美國(guó)Brookhaven公司）；78HW-1型數(shù)顯磁力攪拌器（杭州儀表電機(jī)有限公司）；BS-110型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Inspect S型掃描電子顯微鏡（SEM，美國(guó)FEI公司）；Magna-IR560ESP型傅里葉紅外光譜儀（FTIR，美國(guó)Nicolet公司）；6520型液相色譜質(zhì)譜（LC-MS）分析儀（美國(guó)AB公司）；GW-RO型超純水器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 藥品與試劑

樺木酸原料藥（陜西慧科生物科技有限公司，批號(hào)：111802-201001，純度：98%）；無水乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130408，分析純）；甲醇（江蘇漢邦科技有限公司，批號(hào)：131583，色譜純）；溴化鉀（常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，批號(hào)：20160421，光譜純）；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 反溶劑重結(jié)晶法制備樺木酸納米粒

利用一些有機(jī)溶劑對(duì)樺木酸進(jìn)行溶解度測(cè)試后，選擇乙醇作為溶劑，將一定質(zhì)量的樺木酸原料藥與一定體積的乙醇溶液放入燒杯中，置于恒溫水浴鍋中并在恒溫磁力攪拌器下控制其攪拌的速度，使原料藥充分溶解，得到樺木酸乙醇溶液。待溫度穩(wěn)定后，將一定體積的反溶劑（去離子水）緩慢逐滴加入到樺木酸乙醇溶液中，得到樺木酸納米混懸液。收集樺木酸納米混懸液，8 000 r/min離心（離心半徑：10 cm）10 min，棄上清，取一部分沉淀用等體積的去離子水復(fù)溶，通過Zeta電位及粒度分析儀測(cè)得粒徑大??；另一部分沉淀于－40℃中預(yù)凍12 h，再冷凍48 h，即得樺木酸納米粒。

2.2 單因素試驗(yàn)篩選處方工藝

本研究在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上篩選了5個(gè)對(duì)樺木酸納米粒的形態(tài)和粒徑影響較大的因素，分別為樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度、反溶劑-溶劑體積比、攪拌速度、反溶劑滴加速度和反應(yīng)溫度。每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平：樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度為0.5、1、2、3、4、5 mg/mL；反溶劑-溶劑體積比為0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1；攪拌速度為600、700、800、900、1 000、1 100 r/min；反溶劑滴加速度為2、4、6、8、10、12 mL/min；反應(yīng)溫度為10、15、20、25、30、35℃。分別考察上述因素對(duì)樺木酸納米粒的影響，以粒徑最小原則進(jìn)行篩選，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.1.1 樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度在磁力攪拌速度為900 r/min、反應(yīng)溫度為25℃的條件下，按反溶劑-溶劑體積比4∶1將去離子水以8 mL/min的滴加速度分別加入到質(zhì)量濃度為1、2、3、4 mg/mL的樺木酸乙醇溶液中，制成樺木酸納米粒，測(cè)定其粒徑。結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)所制樺木酸納米粒的粒徑最小，故確定樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度為3 mg/mL，詳見圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig1 Results of single factor test

2.1.2 反溶劑-溶劑體積比在磁力攪拌速度為900 r/min、反應(yīng)溫度為25℃的條件下，按反溶劑-溶劑體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1將去離子水以8 mL/min的滴加速度分別加入到質(zhì)量濃度為3 mg/mL的樺木酸乙醇溶液中，制成樺木酸納米粒，測(cè)定其粒徑。結(jié)果顯示，當(dāng)反溶劑-溶劑體積比為1∶1時(shí)所制樺木酸納米粒的粒徑最小，故確定反溶劑-溶劑體積比為1∶1，詳見圖1。

2.1.3 攪拌速度在磁力攪拌速度分別為700、800、900、1 000 r/min，反應(yīng)溫度為25℃的條件下，按反溶劑-溶劑體積比為1∶1將去離子水以8 mL/min的滴加速度加入到質(zhì)量濃度為3 mg/mL的樺木酸乙醇溶液中，制成樺木酸納米粒，測(cè)定其粒徑。結(jié)果顯示，攪拌速度為900 r/min時(shí)所制樺木酸納米粒的粒徑最小，故確定攪拌速度為900 r/min，詳見圖1。

2.1.4 反溶劑滴加速度在磁力攪拌速度為900 r/min、反應(yīng)溫度為25℃的條件下，按反溶劑-溶劑體積比為1∶1將去離子水以4、6、8、10 mL/min的滴加速度分別加入到質(zhì)量濃度為3 mg/mL的樺木酸乙醇溶液中，制成樺木酸納米粒，測(cè)定其粒徑。結(jié)果顯示，反溶劑滴加速度為8 mL/min時(shí)所制樺木酸納米粒的粒徑最小，故確定反溶劑滴加速度為8 mL/min，詳見圖1。

2.1.5 反應(yīng)溫度在磁力攪拌速度為900 r/min，反應(yīng)溫度分別為15、20、25、30℃的條件下，按反溶劑-溶劑體積比為1∶1將去離子水以8 mL/min的滴加速度加入到質(zhì)量濃度為3 mg/mL的樺木酸乙醇溶液中，制成樺木酸納米粒，測(cè)定其粒徑。結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度為25℃時(shí)所制樺木酸納米粒的粒徑最小，故確定反應(yīng)溫度為25℃，詳見圖1。

綜上單因素試驗(yàn)結(jié)果，樺木酸納米粒的處方工藝條件為：樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度為3 mg/mL，反溶劑-溶劑體積比為1∶1，攪拌速度為900 r/min，反溶劑滴加速度為8 mL/min，反應(yīng)溫度為25℃。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化處方工藝

2.3.1 正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定以樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度（A，mg/mL）、反溶劑-溶劑體積比（B）、反溶劑滴加速度（C，mL/min）和反應(yīng)溫度（D，℃）為因素，按L16（45）表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平：A為1、2、3、4 mg/mL，B為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，C為4、6、8、10 mL/min，D為15、20、25、30℃。以納米混懸液粒徑為指標(biāo)，以粒徑最小原則進(jìn)行篩選，每組試驗(yàn)重復(fù)試驗(yàn)3次，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化樺木酸納米粒處方工藝。因素與水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab2 Orthogonal test design and results

由表2和表3結(jié)果可知，各因素對(duì)樺木酸納米粒粒徑大小的影響程度依次為反應(yīng)溫度＞反溶劑-溶劑體積比＞樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度＞反溶劑滴加速度，其中反溶劑-溶劑體積比、反應(yīng)溫度、樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)粒徑有顯著影響（P＜0.05或P＜0.01）。綜合考慮，確定木酸納米粒的最優(yōu)處方工藝條件為A3B1C3D2，即樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度為3 mg/mL，反溶劑-溶劑體積比為1∶1，反溶劑滴加速度為8 mL/min，反應(yīng)溫度為20℃。

表3 方差分析結(jié)果Tab3 Results of variance analysis

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)按最優(yōu)處方工藝條件，首先稱取30 mg的樺木酸原料藥溶于10 mL的乙醇中，充分溶解得到質(zhì)量濃度為3 mg/mL的樺木酸乙醇溶液；在20℃溫度下，向樺木酸乙醇溶液中以8 mL/min的滴加速度加入反溶劑（去離子水）10 mL，即制備出樺木酸納米混懸液；混懸液離心后凍干制成樺木酸納米粒。試驗(yàn)重復(fù)3次并測(cè)定所制樺木酸納米粒的粒徑。結(jié)果顯示，樺木酸納米混懸液平均粒徑為（156.0±8.6）nm（n＝3），凍干后粒徑為（235.0±12.2）nm（n＝3）。

2.4 樺木酸納米粒表征

2.4.1 SEM分析用SEM分析最優(yōu)處方工藝所制樺木酸納米粒和樺木酸原料藥的形貌和大小。操作步驟：樣品臺(tái)上黏好雙面銅導(dǎo)電膠，在此導(dǎo)電膠上黏附少量樣品，再對(duì)樣品噴金處理（電流為3 mA、時(shí)間為6 min或電流為50 mA、時(shí)間為30 s），將噴金處理后的樣品置于樣品室中觀察。結(jié)果顯示，樺木酸原料藥呈針狀的晶體結(jié)構(gòu)，平均粒徑約在3 000～20 000 nm之間，粒度分布不均勻；樺木酸納米粒呈近球形，大小比較均勻，形態(tài)較規(guī)整，平均粒徑約為300 nm。樺木酸原料藥和樺木酸納米粒的SEM圖見圖2。

圖2 樺木酸原料藥和樺木酸納米粒的SEM圖Fig2 SEM pictures of betulinic acid raw material and nanoparticles

2.4.2 FTIR分析用FTIR分析最優(yōu)處方工藝所制樺木酸納米粒和樺木酸原料藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)。操作步驟：將樣品與溴化鉀粉末按1∶100混合，研成細(xì)粉末、壓片，進(jìn)行紅外光譜分析。結(jié)果顯示，樺木酸納米粒和樺木酸原料藥的紅外吸收峰位置基本相同，說明樺木酸納米粒與樺木酸原料藥對(duì)比，其化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。樺木酸的紅外特征峰為3 522 cm－1為羧基的O—H伸縮振動(dòng)吸收峰，1 760 cm－1為羧基的C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 082、1 035 cm－1為C—O伸縮振動(dòng)吸收峰。樺木酸原料藥和樺木酸納米粒的紅外光譜圖見圖3。

圖3 樺木酸原料藥和樺木酸納米粒的紅外光譜圖Fig3 IR pictures of betulinic acid raw material and nanoparticles

2.4.3 LC-MS分析采用LC-MS分析儀對(duì)最優(yōu)處方工藝所制樺木酸納米粒和樺木酸原料藥的相對(duì)分子量進(jìn)行分析。操作步驟：將樣品5 mg溶于10 mL甲醇溶液中，以10 000 r/min離心（離心半徑：10 cm）10 min，取上清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，樺木酸納米粒的相對(duì)分子量與樺木酸原料藥比較未發(fā)生明顯變化，樺木酸納米粒分子質(zhì)子化之后的質(zhì)荷比為456.3，這一結(jié)果與樺木酸分子式計(jì)算出來的結(jié)果（分子量為456.7）吻合。兩種不同晶型的樺木酸具有相同的分子量，這一結(jié)果與FTIR結(jié)果吻合，由此判斷出通過反溶劑重結(jié)晶法制得的樺木酸納米粒的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。樺木酸原料藥和樺木酸納米粒的LC-MS圖見圖4。

圖4 樺木酸原料藥和樺木酸納米粒的LC-MS圖Fig4 LC-MS pictures of betulinic acid raw material and nanoparticles

3 討論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)樺木酸納米粒的處方工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，最優(yōu)處方工藝條件為：樺木酸乙醇溶液質(zhì)量濃度3 mg/mL、反溶劑-溶劑體積比1∶1、反溶劑滴加速度8 mL/min、反應(yīng)溫度20℃、攪拌速度900 r/min。所制得的樺木酸納米混懸液粒徑為（156.0±8.6）nm（n＝3），凍干后粒徑為（235.0±12.2）nm（n＝3）。

本試驗(yàn)以難溶于水的藥物樺木酸為研究對(duì)象，考察了反溶劑重結(jié)晶法制備樺木酸納米粒的可行性，并對(duì)所制納米粒進(jìn)行了表征，為進(jìn)一步開發(fā)樺木酸新劑型的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Preparation and Characterization of Betulinic Acid Nanoparticles

WU Mingfang，XU Wenjia，ZU Yuangang，ZHAO Xiuhua（Key Laboratory of Forest Plant Ecology，Ministry of Education，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

OBJECTIVE：To prepare the betulinic acid nanoparticles，and characterize them.METHODS：Using ethanol as solvent and water as anti-solvent，anti-solvent recrystallization method was used to prepare betulinic acid nanoparticles.Using particle size as indicator，single factor test and orthogonal test were adopted to optimize the mass concentration of betulinic acid solution，anti-solventsolvent volume ratio，anti-solvent drip rate，reaction temperature and stirring speed in formulation technology of betulinic acid nanoparticles，and verification test was conducted.The betulinic acid nanoparticles were characterized by scanning electron microscopy，laser particle size analyzer，F(xiàn)ourier infrared spectrometer and mass spectrum analyzer.RESULTS：The optimal technology was as follow as betulinic acid solution mass concentration of 3 mg/mL，anti-solvent-solvent volume ratio of 1∶1，anti-solvent drip rate of 8 mL/min，reaction temperature of 20℃and stirring speed of 900 r/min.The average size of prepared betulinic acid nanosuspension was（156.0±8.6）nm（n＝3）and the particle size was（235.0±12.2）nm（n＝3）after freeze-drying，with nearly spherical appearance，uniform size and regular form.Compared with raw material of betulinic acid，the chemical structure of prepared betulinic acid nanoparticles did not change，and there were no significant changes in molecular weight and mass ratio.CONCLUSIONS：Betulinic acid nanoparticles are successfully prepared.

Betulinic acid；Nanoparticles；Anti-solvent recrystallization method；Single factor test；Orthogonal test；Characterization

R943

A

1001-0408（2017）31-4445-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.32

＊博士研究生。研究方向：植物化學(xué)與植物藥。E-mail：604533864@qq.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：藥物新劑型。E-mail：xiuhuazhao@nefu.edu.cn

2017-03-25

2017-08-17）

（編輯：鄒麗娟）