陳 艷，姚 密，李美鳳，孟 曉，冉 旭

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 611137；2.四川大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，四川 成都 610065）

超聲波輔助復(fù)合酶法提取松茸多糖的工藝研究

陳 艷1，姚 密1，李美鳳1，孟 曉1，冉 旭2

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 611137；2.四川大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，四川 成都 610065）

以松茸多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明，超聲波提取優(yōu)化工藝條件為超聲溫度90℃，料液比1∶15（g∶mL），超聲時(shí)間10 min。在此最佳超聲提取條件下松茸多糖得率為11.18%。在超聲波優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行復(fù)合酶處理，最佳酶解工藝參數(shù)為酶解溫度50℃，酶解時(shí)間60 min，復(fù)合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶為1∶1∶1）添加量4.0%，酶解pH值6.0，此優(yōu)化條件下松茸多糖得率為19.56%。復(fù)合酶超聲輔助法比超聲波法提取松茸多糖提高了8.38%。結(jié)果表明，復(fù)合酶超聲輔助提取法提取松茸多糖是一種科學(xué)有效的方法，可顯著提高松茸多糖得率。

松茸；多糖；超聲波；復(fù)合酶；提取工藝

松茸（Tricholoma matsutake）是世界上珍稀名貴的天然藥用菌，被譽(yù)為“菌中之王”，與靈芝、冬蟲(chóng)夏草、羊肚菌等珍貴食用菌相比，松茸位列首位[1]。研究表明，松茸含有松茸多糖、松茸多肽和松茸醇這三種珍稀活性物質(zhì)。此外，還含有蛋白質(zhì)、維生素、脂類、揮發(fā)類以及多種活性酶和豐富的膳食纖維[2-5]。其中，松茸多糖具有抗腫瘤、治療糖尿病、保護(hù)肝臟、美白皮膚、抗氧化、抑菌抗炎以及調(diào)適壓力等作用[6-9]，具有很高的研究?jī)r(jià)值。

目前關(guān)于松茸多糖的提取方法較為單一，主要采用熱水浸提法，酸堿鹽提取法和乙醇提取法，不僅提取率低，而且高溫和過(guò)酸過(guò)堿的環(huán)境易破壞多糖結(jié)構(gòu)，使其生物活性降低，需進(jìn)一步改進(jìn)。綜合考慮提取工藝條件、多糖的活性、結(jié)構(gòu)的完整性以及提取效率，采用微波、超聲波輔助提取或酶工程技術(shù)前景較為廣闊[10]。超聲波輔助提取是利用超聲波的空化效應(yīng)及機(jī)械剪切對(duì)原料的破碎作用，使溶于水的胞內(nèi)多糖溶出，達(dá)到提高多糖得率的目的[11-13]；酶可以分解植物細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)及胞間連絲，從而促進(jìn)胞內(nèi)有效成分的溶出[14-16]。因此本研究采用超聲波輔助復(fù)合酶法提取松茸多糖，并采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，從而提高多糖得率，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用這一藥食兩用真菌資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松茸（干制）：四川雅江；無(wú)水葡萄糖、苯酚、硫酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、正丁醇、三氯甲烷、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；纖維素酶（20 000 U/g）、果膠酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；XL-10B密封型搖擺式粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SHZ-DШ循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HYC-310醫(yī)用冷藏箱：青島海爾特種電器有限公司；SFTDL-6A臺(tái)式低速離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；L2S可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；GZXGF101-2-BS-II/H電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：常州澳華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 松茸多糖提取工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

將干松茸用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩，備用。稱取1.000g松茸粉，按料液比加入蒸餾水，進(jìn)行超聲提?。怀暫蠹尤刖彌_液用酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH值，按1∶1∶1的比例加入纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶，水浴恒溫提取60 min后，90℃滅酶10 min；真空抽濾機(jī)抽濾后取濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至30～50 mL，向濃縮液中加入3倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4℃條件下醇沉過(guò)夜；5 000 r/min離心10 min后收集沉淀，加蒸餾水復(fù)溶，即為粗多糖溶液[17-19]。

1.3.3 松茸多糖含量的測(cè)定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置于25 mL比色管中，各加蒸餾水至1.0mL搖勻，分別加入5%苯酚溶液1.0mL，再迅速加入5.0mL硫酸搖勻，放置10 min后充分混合，置于30℃水浴20 min取出后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，制定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。

（2）松茸多糖得率計(jì)算

將松茸粗多糖溶液用蒸餾水定容至100 mL，取1 mL稀釋100倍，取稀釋液1.0 mL于25 mL具塞比色管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL硫酸，混合均勻，放置10 min，置于30℃水浴20 min，取出后迅速冷卻至室溫。以蒸餾水作為空白，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算葡萄糖的質(zhì)量，計(jì)算樣品中多糖含量。多糖得率的計(jì)算公式如下：

式中：ω為樣品中多糖得率，%；m1為從標(biāo)曲上查得樣品測(cè)定

液中多糖含量，μg；ν1為樣品定容體積，mL；m2為比色測(cè)定時(shí)所移取樣品測(cè)定液的體積，mL；ν2為樣品質(zhì)量，g；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）超聲波提取條件優(yōu)化試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量5份質(zhì)量為1.000g的松茸粉，在超聲功率200W，料液比分別為1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45（g∶mL），超聲溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，超聲時(shí)間分別為5 min、10min、15min、20min、25min的條件下提取多糖，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同料液比、超聲溫度及超聲時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響。每組進(jìn)行3次平行測(cè)定，所得結(jié)果為3次測(cè)定的平均值。

（2）復(fù)合酶超聲波輔助提取條件優(yōu)化試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1.000 g的松茸粉，經(jīng)超聲波提取后，利用磷酸二氫鈉和檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，加入復(fù)合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶為1∶1∶1）分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，在酶解溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下分別酶解30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酶解pH、復(fù)合酶添加量、酶解溫度及酶解時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按紫外-可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=9.5429x-0.0101，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9992。結(jié)果表明，吸光度值與葡萄糖質(zhì)量濃度在0～0.12 mg/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 超聲波處理?xiàng)l件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)松茸多糖得率的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶15（g∶mL）時(shí)，松茸多糖得率最高。料液比較低時(shí)，溶液黏稠度過(guò)大，細(xì)胞沒(méi)有得到充分空化，多糖提取不完全；而料液比過(guò)高，超聲波的能量大部分被溶劑吸收，細(xì)胞中的多糖溶出較少，提取率降低。因此，選取最佳料液比為1∶15（g∶mL）。

圖2 料液比對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides

2.2.2 超聲溫度對(duì)松茸多糖得率的影響

圖3 超聲溫度對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides

由圖3可知，多糖得率隨著超聲溫度的升高而升高，當(dāng)超聲溫度達(dá)到80℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最高，隨著超聲溫度進(jìn)一步升高，多糖得率有所降低。其原因可能是超聲溫度升高，多糖的溶解度隨之升高，當(dāng)超聲溫度升高到一定程度，部分多糖發(fā)生水解，導(dǎo)致提取率降低。因此，選取最佳超聲溫度為80℃。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides

由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)，多糖得率達(dá)到9.97%，此條件下多糖得率最高；當(dāng)超聲時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，多糖在超聲波的機(jī)械剪切和熱作用下發(fā)生破壞和分解，多糖得率降低。因此，最佳超聲時(shí)間為10 min。

2.2.4 超聲波提取松茸多糖最佳工藝條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)超聲提取多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化。選取超聲溫度（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，以松茸多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定超聲提取松茸多糖的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

表1 超聲提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of ultrasound extraction

表2 超聲提取正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results of ultrasound extraction

由表1可知，各因素影響松茸多糖得率的主次順序?yàn)锽＞A＞C，即料液比＞超聲溫度＞超聲時(shí)間。最佳因素水平組合是A3B2C3，即超聲溫度為90 ℃，料液比為1∶15（g∶mL），超聲時(shí)間為15 min。并在此最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，松茸多糖得率達(dá)到11.18%。由表2可知，超聲溫度和料液比對(duì)松茸多糖得率的影響達(dá)到顯著（P＜0.05），超聲時(shí)間對(duì)松茸多糖得率影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 超聲波輔助復(fù)合酶法提取條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在超聲提取多糖的條件下，進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)合酶法提取松茸多糖，以期提高多糖得率。

2.3.1 酶解溫度對(duì)松茸多糖得率的影響

圖5 酶解溫度對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the yield of Tricholoma matsutakepolysaccharides

由圖5可知，多糖得率隨著酶解溫度的升高而增加；當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，多糖得率最大，為17.95%；之后隨著酶解溫度繼續(xù)升高，多糖得率反而呈下降趨勢(shì)。由于酶解溫度升高，反應(yīng)速度加快，酶的活性加強(qiáng)，當(dāng)酶解溫度高于一定范圍，部分酶發(fā)生變性，導(dǎo)致失活，多糖得率也隨之降低。因此最佳酶解溫度為50℃。

2.3.2 酶解pH值對(duì)松茸多糖得率的影響

圖6 酶解pH值對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis pH value on the yield of Tricholoma matsutakepolysaccharides

由圖6可知，隨著酶解pH值的升高，多糖的提取率也明顯增加；當(dāng)pH值為5.0時(shí)，多糖得率最大，為18.05%；之后隨著pH值的進(jìn)一步增加，松茸多糖得率顯著下降。因?yàn)閜H值是影響酶活性的一個(gè)重要因素，在高于最適pH范圍，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，活性遭到破壞，使得多糖提取率降低。因此最佳酶解pH值為5.0。

2.3.3 復(fù)合酶添加量對(duì)松茸多糖得率的影響

由圖7可知，松茸多糖得率隨著復(fù)合酶添加量的增加有明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到3.5%之后，多糖得率達(dá)到平衡。由于復(fù)合酶添加量達(dá)到一定程度時(shí)，溶液呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，松茸的胞內(nèi)多糖已基本溶出，多糖得率不再升高。因此最佳復(fù)合酶添加量為3.5%。

圖7 復(fù)合酶添加量對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.7 Effect of compound enzyme addition on the yield of Tricholoma matsutakepolysaccharides

2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響

圖8 酶解時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.8 Effect of enzymolysis time on the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides

由圖8可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率也隨之增加，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，多糖得率最高，之后隨著酶解時(shí)間進(jìn)一步增加，多糖得率有緩慢下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過(guò)短，酶解不充分，多糖溶出不徹底；而酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致多糖發(fā)生水解。因此，最佳酶解時(shí)間為60 min。

2.3.5 超聲波輔助復(fù)合酶法提取松茸多糖最佳工藝條件的確定

在超聲提取松茸多糖正交試驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、復(fù)合酶添加量（C）、酶解pH值（D）4個(gè)因素中各選取3個(gè)具有代表性的水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以松茸多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定超聲波輔助復(fù)合酶法提取松茸多糖的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

由表3可知，各因素影響松茸多糖得率的主次順序?yàn)镃＞D＞A＞B，即復(fù)合酶添加量＞酶解pH值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。最佳因素水平組合是A2B2C3D3，即酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為60 min，復(fù)合酶添加量為4%，酶解pH值為6.0，并在此最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，松茸多糖得率達(dá)到19.56%。由表4可知，復(fù)合酶添加量和酶解pH值對(duì)松茸多糖得率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），酶解溫度對(duì)松茸多糖得率的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），酶解時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 超聲波輔助復(fù)合酶法提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of ultrasound-assisted compound enzyme extraction

表4 超聲波輔助復(fù)合酶法提取正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results of ultrasound-assisted compound enzyme extraction

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用復(fù)合酶超聲輔助法提取松茸多糖效果顯著，最佳提取工藝條件為料液比為1∶15（g∶mL），超聲溫度90℃條件下超聲提取15 min后進(jìn)行復(fù)合酶提取，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間60 min，復(fù)合酶添加量為4.0%，酶解pH 6.0，該條件下，松茸多糖提取率達(dá)到19.56%。復(fù)合酶超聲輔助法提取松茸多糖比單用超聲波法提取松茸多糖，提取率增加了8.38%。陳煉紅等[21]采用復(fù)合酶法提取松茸多糖，得率為6.95%，相比之下，該方法的得率提高了12.61個(gè)百分點(diǎn)。關(guān)長(zhǎng)亮等[22]采用纖維素酶輔助超聲波法提取松茸多糖得率提高了5.59%。由此可以看出復(fù)合酶超聲波輔助法提取松茸多糖是一種高效可靠的工藝，有一定實(shí)用價(jià)值。

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Ultrasound-assisted compound enzyme extraction technologyof polysaccharide from Tricholoma matsutake

CHEN Yan1,YAO Mi1,LI Meifeng1,MENG Xiao1,RAN Xu2

(1.School of Public Health,Chengdu University of TCM,Chengdu 611137,China;2.Department of Food Science and Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Using polysaccharide yield as evaluation index,the extraction condition was optimized by single factor test and orthogonal test.The results shown that the optimal ultrasonic extraction conditions were temperature 90 ℃,solid-liquid ratio 1∶15(g∶ml),time 10 min,which led to 11.18%polysaccharide yield.Based on the optimized result of ultrasonic extraction,compound enzymes treatment was further carried out.The extraction conditions were optimized by orthogonal experiments as follows:enzymatic hydrolysis temperature 50℃,hydrolysis time 60 min,compound enzyme(papain ∶cellulose enzyme∶pectinase 1∶1∶1)4.0%,buffer solution pH 6.0.In this condition,the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides was 19.56%.Compared with ultrasonic extraction,the extraction rate of polysaccharides fromT.matsutakeby ultrasonic-assisted compound enzyme extraction increased 8.38%.Thus,ultrasound-assisted compound enzyme extraction technology was a scientific and effective method,which can significantly improve the polysaccharide yield.

Tricholoma matsutake;polysaccharide;ultrasonic;compound enzyme;extraction technology

Q556；Q538

0254-5071（2017）10-0139-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.029

2017-07-22

成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（ZRQN1604）

陳 艷（1987-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)楸＝∈称穼W(xué)。