盧先雷

(成都市第五人民醫(yī)院臨床微生物室，成都 611130)

以痰涂片形態(tài)學(xué)為核心的肺曲霉病診斷六步法的介紹

盧先雷

(成都市第五人民醫(yī)院臨床微生物室，成都 611130)

介紹根據(jù)工作實(shí)踐建立的肺曲霉病診斷六步法：以痰涂片鏡檢為核心，包括不染色標(biāo)本查看膿細(xì)胞、1.78 mol/L KOH透明后集菌鏡檢查菌絲、革蘭染色觀察菌絲的包裹現(xiàn)象以及中性粒細(xì)胞的退行性變化，另外綜合應(yīng)用培養(yǎng)、GM試驗(yàn)、CT、PCR等多種手段進(jìn)行肺曲霉病的診斷。肺曲霉病診斷六步法是以痰涂片形態(tài)學(xué)為核心的綜合應(yīng)用多種診斷手段相結(jié)合的診斷體系，可提升該類(lèi)疾病的檢出率，一定程度上減少漏診。

肺曲霉?。伙@微鏡檢驗(yàn)；形態(tài)學(xué)

歐美文獻(xiàn)顯示，肺曲霉感染在所有深部真菌中發(fā)生率始終位居榜首[1]。而曲霉病的早期表現(xiàn)不典型，CT、痰培養(yǎng)、G試驗(yàn)與GM試驗(yàn)等各種診斷手段特異性和敏感性均不盡人意，而當(dāng)各種癥狀表現(xiàn)典型后，疾病已經(jīng)進(jìn)入后期，此時(shí)治療收效甚微，導(dǎo)致肺曲霉感染死亡率較高[2]。美國(guó)感染病協(xié)會(huì)(Infectious Diseases Society of America，IDSA)根據(jù)臨床表現(xiàn)和疾病的進(jìn)展特點(diǎn)將曲霉病綜合分為侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)以及慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis, CPA)，這3類(lèi)不同的疾病類(lèi)型有著不同的臨床轉(zhuǎn)歸，顯微鏡檢查也有不同表現(xiàn)特征[3]。筆者根據(jù)不同類(lèi)型曲霉病的顯微鏡下特征規(guī)律，總結(jié)出肺曲霉病診斷六步法，以供參考。

1 肺曲霉病診斷的六步法

肺曲霉病診斷的六步法是在臨床實(shí)踐中反復(fù)修訂總結(jié)出來(lái)的一套嚴(yán)格的診斷思路，具體方法由以下六步構(gòu)成。

1.1不染色標(biāo)本查看膿細(xì)胞篩查標(biāo)本合格性 曲霉感染具有較強(qiáng)的致炎作用，大量中性粒細(xì)胞滲出是其典型的表現(xiàn)之一[4]，觀察這一指標(biāo)能快速區(qū)分氣道定植與感染[5]。

1.21.78 mol/L KOH透明后集菌鏡檢查菌絲 部分血管侵襲性肺曲霉病與包膜較厚的局灶性肺曲霉球幾乎不侵襲支氣管，排菌少；經(jīng)過(guò)抗真菌治療后復(fù)查痰涂片時(shí)，可能因?yàn)樘狄褐芯刻倩蛘呔z不著色而被漏診；革蘭染色時(shí)，由于大量細(xì)胞背景的掩蓋，容易導(dǎo)致漏診。1.78 mol/L KOH溶液可以快速破壞細(xì)胞，但短時(shí)間內(nèi)對(duì)真菌細(xì)胞無(wú)作用，可使少量的菌絲、孢子暴露在視野下，離心取沉淀物通過(guò)低倍鏡快速搜索，再換高倍鏡確認(rèn)，可快速確認(rèn)曲霉的存在。在高倍鏡下，曲霉菌絲為典型的銳角分支，盲端膨大的鹿角樣菌絲，菌絲分隔，粗且不均勻[6]。見(jiàn)圖1。

注：高倍鏡下可見(jiàn)典型的銳角分支，盲端膨大的鹿角樣菌絲，菌絲分隔，粗且不均勻。

圖1 痰標(biāo)本KOH透明后美藍(lán)染色鏡檢(×400)

1.3革蘭染色觀察菌絲的包裹現(xiàn)象 IPA患者的痰涂片革蘭染色后觀察，可見(jiàn)曲霉菌絲大多被大量的中性粒細(xì)胞所包裹，細(xì)胞緊緊地粘附在菌絲上，形成典型的結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)，菌絲著色或者不著色。此結(jié)構(gòu)在低倍鏡下即可被發(fā)現(xiàn)，再到高倍鏡和油鏡下進(jìn)行確認(rèn)。見(jiàn)圖2。ABPA患者的痰液盡管也呈現(xiàn)膿性，但這種包裹現(xiàn)象沒(méi)有IPA明顯[7]，見(jiàn)圖3。

1.4革蘭染色查看中性粒細(xì)胞的退行性變化 曲霉產(chǎn)生的膠霉毒素(gliotoxin，GT)直接導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的凋亡，而真菌毒素半乳糖胺-多聚半乳糖(galactosamino-galactan，GG)則通過(guò)一些間接的途徑誘導(dǎo)NK細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞的凋亡，這些作用的外在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)就是核固縮與核碎裂[8-10]。該現(xiàn)象出現(xiàn)在曲霉菌絲量少或者缺乏的痰涂片中，提示該病例極大可能是為IPA。見(jiàn)圖4、圖5。而ABPA的核固縮往往缺乏或者直接核溶解。而在CPA中，核固縮的出現(xiàn)極罕見(jiàn)。

注：A，×400，鏡下可見(jiàn)典型的包裹現(xiàn)象，菌絲著色淺，被大量中性粒細(xì)胞所粘附和包裹；B，×1 000，鏡下可見(jiàn)典型的包裹現(xiàn)象，菌絲透明未著色；C，兩幅均為典型的包裹，左圖菌絲相互纏繞，但未著色，右圖部分著色，菌絲銳角分支，分隔，末端膨大，狀如鹿角。

圖2 侵襲性肺曲霉感染患者痰標(biāo)本直接涂片革蘭染色觀察菌絲的包裹現(xiàn)象

注：大量菌絲，包裹現(xiàn)象不明顯，中性粒細(xì)胞均勻分布，細(xì)胞核發(fā)生核溶解。

圖3 變應(yīng)性支氣管肺曲霉病痰涂片革蘭染色鏡檢(×1 000)

注：A、B，菌絲缺乏；C、D，核固縮與曲霉菌絲同時(shí)存在。黑色箭頭所指為中性粒細(xì)胞核固縮。

圖4 侵襲性肺曲霉感染患者痰標(biāo)本直接涂片革蘭染色鏡下中性粒細(xì)胞核固縮現(xiàn)象(×1 000)

1.5真菌培養(yǎng)及鑒定 根據(jù)曲霉在PDA平板上的顏色不同，將曲霉分為煙色、黃色、雜色、黑色、土色等組，有助于區(qū)分氣道定植、氣道變應(yīng)性和侵襲性，以及判斷入血的可能性[11]。通過(guò)筆者的病例調(diào)查，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致IPA的主要是PDA上煙色組曲霉，而其他種罕見(jiàn)；而PDA上黃色組曲霉似乎只與ABPA有一些關(guān)系，痰培養(yǎng)陽(yáng)性也大多屬于氣道定植，這與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)論一致；PDA上土色組曲霉則更多導(dǎo)致肺外感染，例如曲霉性鼻竇炎，顱內(nèi)感染和血流感染；PDA上黑色組曲霉和黃色組曲霉與曲霉性外耳道炎關(guān)系較密切，在肺部感染中極其罕見(jiàn)。

圖5 侵襲性肺曲霉感染患者痰標(biāo)本直接涂片革蘭染色鏡下中性粒細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象(箭頭所指)(×1 000)

PDA菌落形態(tài)只是初步分組的依據(jù)之一，還需要結(jié)合菌落的乳酸棉酚藍(lán)染色結(jié)果，根據(jù)分生孢子梗、分生孢子、頂囊、小梗(以及瓶梗)以及子囊的有無(wú)和形態(tài)作進(jìn)一步鑒定。然而，即便有形態(tài)學(xué)鑒定手段，依然很難將曲霉鑒定至種，種級(jí)水平的鑒定往往依賴(lài)分子手段，例如內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)間(ITS)、鈣調(diào)蛋白基因、18S rRNA序列分析等。

1.6綜合運(yùn)用涂片、培養(yǎng)、GM試驗(yàn)、灌洗液PCR、CT診斷和肺活檢進(jìn)行疾病診斷 由于肺曲霉病的早期診斷的困難，單靠一種手段難以做到快速和準(zhǔn)確，多手段綜合應(yīng)用，相互補(bǔ)充將是今后曲霉感染診斷的共同方向。(1)痰涂片快速、直觀，可準(zhǔn)確反映感染與氣道定植，并可以根據(jù)涂片進(jìn)行初步的分型，見(jiàn)表1。但陽(yáng)性率依然不如灌洗液PCR和肺活檢。(2)培養(yǎng)可以準(zhǔn)確鑒定曲霉菌，但對(duì)于臨床意義的判斷，痰涂片的價(jià)值也不容小窺。(3)血清GM試驗(yàn)對(duì)于IPA的準(zhǔn)確度很高，與肺穿組織活檢有較高的符合率，然而因其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值過(guò)低，限制了該試驗(yàn)在臨床的應(yīng)用。近些年來(lái)有學(xué)者推薦采用肺泡灌洗液做GM試驗(yàn)可大大提升該試驗(yàn)的陽(yáng)性率[13]。由于cut off值的設(shè)定依然沒(méi)有統(tǒng)一，不同廠家試劑和不同文獻(xiàn)方法學(xué)的差異，該試驗(yàn)到目前為止還處于評(píng)價(jià)總結(jié)階段。(4)灌洗液PCR擴(kuò)增曲霉基因，在診斷肺曲霉病的所有方法學(xué)中陽(yáng)性率最高，但該方法只報(bào)告肺部(包括氣道內(nèi))有曲霉的存在，但究竟是氣道定植、支氣管變應(yīng)性還是侵襲性無(wú)法鑒別。(5)CT診斷是反映肺部病變特征和程度的優(yōu)秀診斷手段，但因同病異像以及異病同像的存在導(dǎo)致該方法在曲霉診斷中依然屬于模糊性手段，還需要大量其他指標(biāo)作為補(bǔ)充性鑒別診斷。(6)肺活檢屬于肺曲霉病診斷中的確診手段。然而肺活檢因其侵入性采樣的高風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)醫(yī)生采用該方法的適用性評(píng)價(jià)能力和操作嫻熟程度要求非常高，目前還無(wú)法全國(guó)性推廣。在曲霉診斷中，該方法所占比例非常低。肺曲霉病不同臨床分型臨床常用的各種診斷手段的比較見(jiàn)表2。

表1 不同分型曲霉菌病的痰涂片表現(xiàn)

表2 各類(lèi)型肺曲霉菌病診斷要點(diǎn)與方法學(xué)評(píng)價(jià)[2]

注：*,血清GM試驗(yàn)敏感性低，不提倡采用。

此外，ABPA的確診方法還包括總IgE升高，曲霉特異IgE>1 000 IU/mL；痰標(biāo)本直接涂片瑞氏染色發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量與比例的增加，見(jiàn)圖6；以及臨床癥狀胸悶喘憋、反復(fù)膿痰，抗生素治療無(wú)效，抗真菌治療可緩解癥狀；真菌培養(yǎng)與PCR檢測(cè)持續(xù)陽(yáng)性與CT缺乏典型肺組織侵襲表現(xiàn)或者僅表現(xiàn)為氣道內(nèi)痰栓形成也是診斷ABPA的關(guān)鍵要點(diǎn)[2]。

注：鏡下可見(jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞。

圖6 變應(yīng)性支氣管肺曲霉病患者痰標(biāo)本直接涂片瑞氏染色(×1 000)

2 總結(jié)

肺曲霉病診斷六步法是以痰涂片形態(tài)學(xué)為核心的綜合應(yīng)用多種診斷手段的診斷體系，可以對(duì)肺曲霉病做出快速而準(zhǔn)確的診斷，為臨床最終確認(rèn)和治療肺曲霉菌病提供有力的支持。需要注意的是,由于肺曲霉病在不同基礎(chǔ)疾病人群中，以及同一疾病不同階段中表現(xiàn)的不典型性和多變性，任何單一的手段在肺曲霉菌的診斷中都是局限的，綜合應(yīng)用多種手段，相互補(bǔ)充，才是提高肺曲霉病診斷陽(yáng)性率和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。

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2017-04-25)

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.06

盧先雷，1974年生，男，主管技師，大專(zhuān)，從事臨床微生物檢驗(yàn)、抗菌藥物合理應(yīng)用以及微生物檢驗(yàn)試劑研發(fā)工作。

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