陳東科，鄧存興，許宏濤

(1.北京醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.珠海美華醫(yī)療科技有限公司，廣東珠海 519000)

·臨床檢驗技術(shù)研究·

全封閉一次性小培養(yǎng)基的研制及其在絲狀真菌小培養(yǎng)中的應(yīng)用

陳東科1，鄧存興2，許宏濤1

(1.北京醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.珠海美華醫(yī)療科技有限公司，廣東珠海 519000)

目的研制一種安全實用的一次性真菌小培養(yǎng)基。方法參照鋼圈小培養(yǎng)法原理。底板選用透明度高的PVC為原材料，同常規(guī)使用的載玻片大小(25.2 mm×75.9 mm×1.05 mm)，板面兩端磨砂設(shè)計；圓形培養(yǎng)皿直徑19.4 mm，側(cè)面高3.75 mm，其上接種孔直徑為2.4 mm，可隨用戶需求灌注PDA瓊脂等培養(yǎng)基，加孔塞封閉；上封蓋片采用鋼化玻璃制成。一次性真菌小培養(yǎng)基用培養(yǎng)濕盒進行保存，兩端水槽內(nèi)加海綿條，加蓋密封蓋。分別觀察臨床絲狀真菌在該全封閉一次性小培養(yǎng)基中的生長狀況、鏡下形態(tài)及染色效果以及培養(yǎng)基的保存效果。結(jié)果該全封閉一次性小培養(yǎng)基實際應(yīng)用效果良好，真菌生長狀況可視、色素明顯，鏡下可觀察到真菌原生態(tài)生長形態(tài)，可直接進行染料灌注染色，且效果良好。培養(yǎng)基包裝后于4 ℃保存3個月后外觀不變，量未見減少。結(jié)論成功研制一種操作簡單、透明度高、密封效果好、培養(yǎng)性能可靠、生物安全性高的全封閉一次性小培養(yǎng)基?？呻S時在鏡下觀察生長狀況、適用于油鏡下直接觀察、可直接進行棉藍染色，臨床試用效果良好，適用于各級實驗室的真菌形態(tài)學(xué)檢查。

真菌小培養(yǎng)基；全封閉；一次性使用

真菌培養(yǎng)鑒定是傳統(tǒng)的用于真菌感染檢測的方法，除少數(shù)真菌培養(yǎng)不成功外，多數(shù)真菌能人工培養(yǎng)。真菌培養(yǎng)鑒定的目的是提高病原真菌檢出的陽性率、確定病原菌的種類、進行藥敏試驗，為臨床診斷及選藥治療提供可靠的依據(jù)。依現(xiàn)在的科技水平，通過生化鑒定、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜、分子生物學(xué)及DNA測序等方法可對真菌進行準確鑒定，但是在實際工作中絕大多數(shù)臨床實驗室對絲狀真菌還是以形態(tài)學(xué)鑒定為主要手段，尤其在不具備高端檢測設(shè)備的基層實驗室。因此，觀察真菌菌落形態(tài)、顏色變化及真菌不同生長時期的鏡下特征(菌絲、孢子及特殊結(jié)構(gòu)的形態(tài))對正確鑒定真菌具有重要意義[1-2]。本文介紹并評價一種安全實用的全封閉一次性真菌小培養(yǎng)基(專利號：2016211258280)，供廣大讀者參考。

1 研發(fā)背景

1.1各種小培養(yǎng)方法的優(yōu)缺點 絲狀真菌的培養(yǎng)方法可分為試管法、平板法(大培養(yǎng))和小培養(yǎng)法，其中小培養(yǎng)法主要用于菌種鑒定。小培養(yǎng)法大致分為以下3種。(1)玻片法：該方法主要用于念珠菌的厚壁孢子和假菌絲鑒別，也可用于絲狀真菌培養(yǎng)，缺點是開放性操作、污染嚴重；(2)瓊脂塊法：該方法適用于絲狀真菌顯微鏡下形態(tài)學(xué)的觀察，缺點是開放性操作、污染嚴重，瓊脂塊法能保持菌體的完整性但不適用于快速產(chǎn)菌絲的真菌；(3)鋼圈法：該方法適用于絲狀真菌顯微鏡下形態(tài)學(xué)的動態(tài)觀察，優(yōu)點是形成一種封閉式培養(yǎng)，在顯微鏡下直接觀察菌落時可避免孢子進入空氣中或吸入人體，不易被空氣中的真菌污染，蓋玻片也可取下染色后封固制片保存，缺點是操作較繁瑣、易致雜菌污染培養(yǎng)基、稍不小心常會壓破蓋玻片而損壞標本并造成顯微鏡污染。

1.2各種絲狀真菌染色方法的優(yōu)缺點 臨床實驗室常用的絲狀真菌染色制片法主要有透明膠帶粘片法和瓊脂塊小培養(yǎng)揭片法[3]。透明膠帶粘片法的優(yōu)點是操作方便，缺點是開放性操作、污染無法控制、粘起來的菌體結(jié)構(gòu)不完整、膠帶與載玻片間的間隙無法控制而造成鏡下觀察時圖片采集困難(菌體不在同一焦面上)，見圖1。瓊脂塊小培養(yǎng)揭片法的優(yōu)點是能保持菌體形態(tài)的完整及真菌生長狀態(tài)的原生態(tài)展現(xiàn)，缺點是開放性操作，污染無法控制。

注：A,層生鐮刀菌,孢子脫落嚴重;B,毛殼菌菌體形態(tài)不完整;C,犁頭霉,孢囊清晰梗基模糊。

圖1 透明膠帶粘片法的形態(tài)學(xué)觀察(×400)

2 全封閉一次性小培養(yǎng)基

2.1設(shè)計要點 參照鋼圈小培養(yǎng)法原理。見圖2。

圖2 一次性小培養(yǎng)基全貌

2.1.1基本材料及尺寸大小 全骨架使用PVC材料制作，提升安全性能；底板與普通載玻片大小厚薄一致，大小為25.2 mm×75.9 mm×1.05 mm，便于固定在顯微鏡載物臺上；板面兩端設(shè)計為磨砂面，方便記錄菌株信息。

2.1.2核心結(jié)構(gòu) 培養(yǎng)皿設(shè)計為圓形，高3.75 mm、直徑19.4 mm；接種孔直徑為2.4 mm，封孔加塞保濕；上封蓋片采用鋼化玻璃制成，可使用油鏡觀察，透明性及安全性能高；培養(yǎng)基可隨用戶需求進行灌注，通用型為PDA瓊脂；底板為高透明度的PVC材料，可隨時觀察菌絲、產(chǎn)孢及特殊結(jié)構(gòu)，也滿足拍攝的需要。

2.1.3保存 采用培養(yǎng)濕盒保存。濕盒兩端水槽內(nèi)加海綿條，加密封蓋保存。培養(yǎng)盒經(jīng)過消毒液浸泡后可重復(fù)使用。見圖3、圖4。

圖3 保濕盒設(shè)計

圖4 密封蓋設(shè)計

2.2接種方法 接種方法同鋼圈法。要求接種單一菌種，盡量靠近上板面接種(見圖5)，方便鏡檢。如果標本直接涂片見到可疑為真菌又無其他雜菌時，可直接挑取可疑部分接種在一次性小培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)(見圖6)。接種后對接種孔進行加塞封口，然后放入培養(yǎng)盒，加無菌水于培養(yǎng)盒兩端的海綿槽內(nèi)，蓋好封蓋放入培養(yǎng)箱。

圖5 小培養(yǎng)接種

圖6 直接接種鏡檢陽性的痰標本

3 臨床應(yīng)用

3.1生長狀況觀察 對生長快的真菌每天進行生長狀況觀察，慢生長菌可每3天或一周觀察一次，每次觀察時最好用鑷子拔起孔塞進行氧的置換，而后即刻塞緊(見圖7)。對有明顯生長的真菌要記錄生長狀況，如氣生菌絲、基生菌絲、菌落顏色等(見圖8)，并記錄培養(yǎng)時間、溫度等信息。

圖7 拔塞通氣

注：A，氣生菌絲；B，基生菌絲(阿薩希毛孢子菌)；C，馬爾尼菲藍狀菌96 h產(chǎn)酒紅色素； D，枝孢霉7 d黑色菌落；E，黃曲霉(72 h)；F，塔賓曲霉(48 h)。

圖8 真菌生長菌絲及色素狀況觀察

3.2鏡下形態(tài)觀察 對肉眼看到有菌落生長的真菌應(yīng)每天(或隔天)在鏡下進行觀察，無孢子及特殊結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)，有產(chǎn)孢或特殊結(jié)構(gòu)的應(yīng)拍照記錄，并與圖譜進行比對，形態(tài)相同或接近的可作為初步鑒定的依據(jù)(見圖9)。同時記錄產(chǎn)孢的時間、溫度等信息。

3.3染色及效果觀察 對需要進行染色觀察的真菌，可直接從接種孔加乳酸酚棉藍染液進行染色(見圖10)，待染液滲入瓊脂后(或吸出多余染液)進行鏡檢(見圖11)。

3.4保存密封效果 培養(yǎng)基包裝后于4 ℃保存3個月后觀察，培養(yǎng)基外觀不變，量未見減少(即水份未蒸發(fā))。

圖9 真菌鏡下形態(tài)觀察

圖10 直接乳酸酚棉藍染色

圖11 真菌染色后形態(tài)觀察

4 討論

醫(yī)學(xué)真菌學(xué)檢查是診斷真菌病的重要依據(jù)，不論是對淺部或深部感染的診斷，必須依賴于臨床標本的常規(guī)和特殊檢查。常規(guī)檢查法主要包括：形態(tài)學(xué)檢查(直接鏡檢+染色鏡檢)、培養(yǎng)檢查和組織病理學(xué)檢查。特殊檢查主要包括血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。《人間傳染的病原微生物名錄》中規(guī)定，除了少數(shù)高致病性真菌需要在BSL-3級實驗室操作外，其余真菌均應(yīng)該在BSL-2級實驗室操作?！禤2實驗室的建設(shè)與使用指南》中要求，對所有開放性操作都應(yīng)在Ⅱ級生物安全柜中進行。《侵襲性真菌臨床實驗室診斷操作指南》[4]要求，開展侵襲性真菌實驗室檢驗必須在具備Ⅱ級生物安全防護的實驗室中進行，指南中推薦的瓊脂塊小培養(yǎng)法及透明膠帶粘菌法都屬于開放性操作，對生物安全柜、實驗室環(huán)境及實驗人員的防護都是嚴峻的考驗。

全封閉一次性小培養(yǎng)基的設(shè)計充分考慮了以下方面。上封蓋片采用了鋼化玻璃材料，一是為了油鏡可視，因為PVC材料最薄只能做到0.8 mm厚，超出了油鏡頭的聚焦范圍；二是可脫油后繼續(xù)培養(yǎng)，因為PVC材料可被各種脫油劑不同程度的溶解，嚴重影響其透明度；三是確保不易破碎，提高生物安全防護，而普通蓋玻片易碎不安全。考慮到培養(yǎng)基量少、培養(yǎng)時間長的因素，設(shè)計為小接種孔、加塞保濕；為最大限度地降低真菌外溢污染和環(huán)境菌對培養(yǎng)基的污染，采取了加塞和加密封蓋的雙重保險措施；還可根據(jù)用戶需求加不同培養(yǎng)基，通用培養(yǎng)基為PDA；選用低成本的PVC材料做小培養(yǎng)可降低成本，實現(xiàn)一次性使用，從而減少了配制及制作培養(yǎng)基的環(huán)節(jié)，解決了微生物實驗室人員普遍不足的實際問題，也極大地促進了規(guī)范化操作進程。

[1]陳東科，孫長貴. 實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2011.

[2]王端禮. 醫(yī)學(xué)真菌學(xué)-實驗室檢驗規(guī)范[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社,2005.

[3]陳東科.濕片封片技術(shù)在臨床微生物鏡檢中的應(yīng)用[J].臨床檢驗雜志,2017,35(1):42-44.

[4]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. WS/T497-2017.侵襲性真菌病臨床實驗室診斷操作指南[S]. 北京：中國標準出版社，2017.

2017-06-27)

(本文編輯：劉群)

Developmentoftotallyenclosedslideculturemediumanditsapplicationinfilamentousfungiculture

CHENDong-ke1,DENGCun-xing2,XUHong-tao1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,BeijingHospital,Beijing100730; 2.ZhuhaiMeihuaMedicalTechnologyLimited,Zhuhai519000,Guangdong,China)

ObjectiveTo develop a safe, practical, disposable slide culture medium for fungi culture.MethodsBased on the principle of traditional slide culture medium with small steel ring, a plate of polyvinyl chloride (PVC) with high transparency was chosen as the bottom material of the new medium which held the size of the conventional slide (25.2 mm×75.9 mm×1.05 mm) with frosted design at both ends. The diameter of inoculation hole was 2.4 mm on the rounded culture dish which was designed with diameter of 19.4 mm and side height of 3.75 mm. The users could inject potato dextrose agar (PDA) or other medium into the culture dish as needed and then sealed it with a plug. The upper cover was prepared with toughened glass. The improved disposable slide culture medium should be kept in humidifying box with sponge strips in the water tanks of both sides and sealed with cap. The growth status, microscopic morphology and staining result of filamentous fungi in the totally enclosed slide culture medium were observed and the preservative status of the prepared medium was also monitored simultaneously.ResultsThe effects of the improved slide culture medium were satisfactory in clinical practical application. The growing status of fungi could be observed visually and the pigment was clear. The original growth form of fungi could be monitored under microscope and dye material could be perfused directly to stain with good results. The appearance and the volume of packaged slide medium were unchanged after preservation at 4 ℃ for 3 months.ConclusionAn improved slide culture medium was successfully developed, which should be easy to operate, high visible, satisfactory for sealing effects and reliable for culture performance with high biological safety. The growth status of fungi could be observed under microscope at any time, and the medium could also be monitored under oil immersion lens directly and stained with cotton blue. The improved medium could be used in morphological examination for fungi in different levels of medical laboratories since its favorable results in clinical application.

slide culture medium for fungi; totally enclosing; disposable application

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.05

陳東科，1961年生，男，副主任技師，擅長微生物形態(tài)學(xué)檢查與圖片拍攝。

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