陳東科，孫長貴

(1.北京醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.中國人民解放軍第一一七醫(yī)院檢驗科，杭州 310013)

·專家論壇·

微生物圖片拍攝技術的應用探討

陳東科1，孫長貴2

(1.北京醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.中國人民解放軍第一一七醫(yī)院檢驗科，杭州 310013)

微生物形態(tài)學圖片在微生物鑒定、臨床涂片報告(圖文報告)、鑒定儀器的專家系統(tǒng)、室間質量評價、教學及學術交流、資料保存等方面十分重要，因此，拍攝微生物圖片是臨床微生物檢驗人員需要掌握的技能之一。該文介紹了拍攝微生物圖片需要運用到的攝影知識，拍攝前對制片、染色和培養(yǎng)的要求，手工或輔助拍攝裝置，探討拍攝不染色和染色標本鏡下形態(tài)、感染部位、菌落形態(tài)、藥物敏感性試驗的圖片時對構圖、背景、光線、比例尺等的運用技巧和注意事項，指出拍攝圖片的清晰度與拍攝器材的像素、拍攝穩(wěn)定性、光線等有直接關系，鏡下圖片的拍攝效果用輔助拍攝裝置的比手持拍攝效果好，菌落拍攝除設備外還與拍攝技巧有關。

微生物；形態(tài)學；圖片；攝影技術

形態(tài)學檢驗對微生物鑒定具有導航的作用，正確的形態(tài)學檢驗結果是準確鑒定細菌的堅實基礎[1]。作為基本功的形態(tài)學知識，是每一位微生物檢驗技術人員必須掌握的技能。在實際工作中微生物形態(tài)學圖片的用途非常廣泛，如臨床涂片報告(圖文報告)[2]、鑒定儀器的專家系統(tǒng)、室間質量評價[3]、教學、資料保存、發(fā)表論文、編輯圖譜[4]等都需要清晰的圖片。因此，學會拍攝微生物圖片也成為臨床微生物檢驗人員需要掌握的技能之一。本文介紹微生物鏡下及菌落形態(tài)的拍攝技巧，探討臨床微生物檢驗圖片拍攝有關的技術、輔助設備及拍攝技巧，以期指導微生物檢驗工作者拍出滿意的圖片，可以滿足各方面的應用需求。

1 拍攝前的準備工作

1.1涂片 要拍出病原體在標本中的生存狀態(tài)、形態(tài)特征及染色特性，制片十分重要。無論是不染色片和染色片，制片的基本原則是盡可能保持標本的結構不被破壞，單層細胞厚度。片子染色后整片著色均勻一致、細胞核與細胞漿清晰、菌體是被吞噬或是黏附可辨，這是圖片拍攝對涂片的基本要求。

1.2染色 按照染色操作要求進行，并以質控片達標在控為準。自動染片機的使用應根據(jù)制片的厚薄采用不同的程序進行染色，同時用質控片進行質控。革蘭染色質控片制備：挑取經過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌(推薦用ATCC標準菌株)，各配制成2麥氏濁度單位濃度的菌液，兩菌液混勻后挑取一接種環(huán)涂成直徑1.5 cm的菌斑，過火焰熱固定后備用。其他質控片可選相應的陽性菌株或標本經滅活后制備。

1.3菌株 對細菌(真菌)形態(tài)學的正確描述依賴于方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、染色試劑等，培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間不同會影響細菌的形態(tài)。觀察細菌(真菌)的典型形態(tài)，應該將細菌(真菌)接種在該菌最適生長的培養(yǎng)基上、放入最適生長環(huán)境中(包括溫度、濕度和所需氣體條件等)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間應視該菌的生長速度而定，大部分常見的細菌以培養(yǎng)24 h為宜，有些細菌(真菌)需要更長時間的培養(yǎng)才能顯現(xiàn)出典型的菌落特征。

1.4顯微鏡 需要安裝圖像采集器或照相機的用戶，必須準備三目顯微鏡。

1.5攝影器材 理想圖片的獲得必須有適合的攝影器材。隨著數(shù)碼時代的到來，各式各樣的專業(yè)攝影設備應運而生，品種繁多。各實驗室應根據(jù)實驗室條件和經濟實力購買適當?shù)臄z影器材，最低配置應該至少能拍出達到打印圖文報告和出版要求的圖片。細菌拍攝用顯微鏡電子圖像采集系統(tǒng)應配置像素不低于1 000萬的電子攝像頭。在實際工作中，用手機拍攝圖片經濟、操作簡單、方便交流，對基層單位是不錯的選擇。但是用手機拍攝顯微鏡下圖片時遇到的最大問題是手持拍攝不穩(wěn)定、抓屏困難、對焦不準，很難拍到符合要求的圖片。手持拍攝需要一定的技巧和訓練，巧妙尋找支撐點，掌握要領后也可以拍出不錯的圖片(見圖1)。手機拍攝輔助器從簡易的紙筒輔助拍攝器(見圖2)發(fā)展到固定式的輔助拍攝器，如DONGKE LENs輔助拍攝系統(tǒng)(見圖3)。

圖1 用手機手持拍攝技巧

圖2 紙筒輔助拍攝器

1.6攝影基本知識 曝光、對焦和構圖是攝影的三要素。以下列出了攝影必須掌握的一些基本知識，更為深入的知識可參閱相關專業(yè)書籍[5]。

1.6.1曝光四要素 光線、光圈、快門和感光度。光線越強照片越明亮，光圈越大越明亮，快門越慢越明亮，感光度越高越明亮。

1.6.2光線3個特性 強度、方向和色溫。強度是指亮不亮，方向是指光從哪里來，色溫是指光源發(fā)射光的顏色與黑體在某一溫度下輻射光色相同時，黑體的溫度稱為該光源的色溫。

圖3 固定式輔助拍攝器

1.6.3光線的3個類型 自然光、場景光和人造光。自然光光譜范圍廣，色彩還原最佳。場景光往往指拍攝現(xiàn)場所有可用的光源發(fā)出的光，光源復雜、強度較弱。人造光是指由人工設計制造的儀器、設備產生的光，如日光燈的光、激光等，常用的人造光設備如閃光燈。

1.6.4景深三要素 光圈、焦距和對焦距離。光圈越大景深越淺，焦距越長景深越淺，對焦距離越近景深越淺(背景越模糊)。

1.6.5感光度 感光度是指膠片或感光器對光的靈敏程度，用ISO表示。感光度越高，對光線越敏感。高感光度下的圖像細節(jié)損失造成了照片不清晰。相反，感光度低，圖像噪點減少，畫質細膩。

1.6.6對焦 是指通過改變鏡頭與感光器之間的距離，讓某一個特定位置的物體通過鏡頭的成像焦點正好落在感光器之上，得出最清晰的影像。對焦不準確，則拍攝的圖片不清晰。

1.6.7構圖 構圖是指如何把人、景、物安排在畫面當中以獲得最佳布局的方法。構圖的目的是對拍攝的主題加以強調、突出。

2 臨床微生物圖片拍攝方法

臨床微生物檢驗圖片拍攝內容主要包括患者的感染部位、標本性狀、病原體(寄生蟲等)、標本涂片鏡檢結果(染色或不染色)、菌落特征、純菌涂片鏡檢結果(包括菌體的特殊結構等)、生化反應及輔助試驗結果、藥敏試驗及耐藥機制檢測結果等。對于不同的拍攝對象，要采用不同的拍攝方法進行拍攝。拍攝技巧的掌握與應用可以大幅度提高圖片的質量。高質量的圖片不僅是把拍攝對象拍清楚，還要求能表現(xiàn)出被拍攝對象細微、典型的特征，這對菌株間的鑒別至關重要。

2.1感染部位拍攝 有些病原體感染人體后會產生特殊的體征，如麻風、皮膚炭疽、猩紅熱、葡萄球菌皮膚燙傷樣綜合征、麻疹、干性或氣性壞疽、真菌性角膜炎、軟下疳、梅毒、鵝口瘡、白喉、破傷風、糠秕疹(由馬拉色菌引起)、孢子絲菌病(“玫瑰手”)、黃癬(由許蘭毛癬菌引起)、黑癬(由紫色毛癬菌引起)、疊瓦癬(由同心性毛癬菌引起)、足腫病、囊蟲病、血吸蟲病和絲蟲病等，對于鑒別診斷具有指導意義。因此對于感染部位的拍攝顯得十分重要。

拍攝前需要對感染部位進行評估，選擇最具有代表性的部位進行拍攝。要求對焦準確，光線充足。最好是自然光，光線不足時可采用輔助光，如臺燈等可移動燈具，或是使用閃光燈，同時注意距離和角度，避免曝光過度。

2.2標本涂片鏡檢結果拍攝 直接涂片鏡檢對于感染性疾病病原的診斷有重要的意義，是一種快速、簡便有效的微生物檢驗手段，可為臨床醫(yī)生早期診斷、合理的經驗選用抗菌藥物提供參考依據(jù)。

2.2.1不染色標本拍攝 不染色標本涂片通常采用直接壓片法制片，一般只在低倍或高倍鏡下觀察，很少使用油鏡觀察。將顯微鏡的聚光器下調到適當位置，以獲得最佳亮度，此時被拍攝對象的輪廓及層次清晰分明。(1)動態(tài)視頻拍攝：適用于活體標本的直接鏡檢拍攝，如細菌運動方式、阿米巴滋養(yǎng)體、藍氏賈第鞭毛蟲、滴蟲等。要求標本新鮮(必要時保溫)，拍攝要穩(wěn)(建議固定拍攝)，實時調焦(即跟蹤拍攝)。(2)圖片拍攝：由于沒有進行染色，病原體與背景的色差不大，需要調節(jié)聚光器，以突出病原體(見圖4)。拍攝寄生蟲等較大個體時需要注意細節(jié)，寄生蟲相對于真菌和細菌個體較大，個體長度大于10 mm可直接用微距鏡頭進行拍攝，但細節(jié)表現(xiàn)不會太好，建議在顯微鏡下拍攝細節(jié)部分。由于個體大、厚度高，要想用一個鏡頭拍攝完整蟲體幾乎不可能，只能分層拍攝，或是將蟲體壓扁后進行拍攝。要拍攝蟲體器官，必須進行染色。寄生蟲拍攝的重點在口器、尾器、交合器和臟器的細節(jié)，蟲卵拍攝也同樣要注重卵內細節(jié)，如鉤蟲卵的卵膜和齒、鞭蟲卵的核、蛔蟲卵的膜等。

圖4 痰液KOH壓片見煙曲霉菌絲(×400)

2.2.2染色標本拍攝 拍攝前，先對整張涂片進行觀察，選擇最具代表性的視野進行拍攝，每個視野可調節(jié)不同焦距面進行拍攝，在不同層面上反映出病原體在標本中的狀態(tài)。對大小不同的拍攝對象應選用不同的物鏡頭進行拍攝，盡量拍出其完整性(如諾卡菌革蘭染色選用100倍物鏡頭，煙曲霉革蘭染色選用20倍物鏡頭，見圖5)。

注：A，諾卡菌(×1 000)；B，煙曲霉(×200)。

圖5 痰涂片革蘭染色鏡檢效果

2.3菌落拍攝 細菌和真菌在固體培養(yǎng)基表面生長形成菌落。對菌落進行描述應包括菌落大小、形狀、高度、邊緣、表面狀態(tài)、密度(透明度)、菌落內部結構、顏色、光澤以及與培養(yǎng)基表面的黏附程度，還應包括菌落的溶血和色素產生情況等特性。根據(jù)菌落特征可對細菌和真菌進行初步鑒定。有些特征是某些細菌和真菌所特有的，具有屬或種的鑒別價值，如肺炎鏈球菌在綿羊血瓊脂平板上的臍窩樣菌落、伴放線聚集桿菌菌落特殊的內部結構、侵蝕艾肯菌的斗笠樣菌落、斯氏假單胞菌皺紋樣菌落、變形桿菌遷徙樣菌落，酵母、酵母樣真菌、絲狀真菌等。見圖6。

觀察細菌和真菌色素的產生，最好在沒有顏色的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，如營養(yǎng)瓊脂、MHA、PDA、察氏瓊脂等，以減少背景顏色對真實顏色的干擾。拍攝前的構思很重要，要根據(jù)不同菌落特性選擇不同的拍攝方法，要求拍出菌落的主要特征和局部細節(jié)，拍出的菌落不變形，菌落顏色保真，標注放大倍數(shù)。對菌落局部細節(jié)的拍攝可能要借助放大鏡或顯微鏡來完成，應用輔助光是必須的，最好使用專業(yè)光源，也可使用臺燈，但要注意顏色的保真，可適時調節(jié)白平衡(可設置成自動調節(jié))。平板放置的平臺建議選擇合適的背景顏色，基本原則是深色平板(如血平板、巧克力平板)用淺色或白色背景；淺色平板選擇深色背景，如營養(yǎng)瓊脂平板或SDA平板等應該選擇黑色或藍色背景。拍攝大菌落(菌落直徑>1 mm)時可拍全平板，拍攝小菌落(菌落直徑<1 mm)時最好拍攝菌落分布較均勻的局部。拍攝菌落特征時可針對單個菌落進行拍攝，必要時可借助放大鏡或在顯微鏡下拍攝。拍攝菌落內部結構時需要采用逆光(透射光)進行拍攝。

注：A，肺炎鏈球菌臍窩狀菌落；B,諾卡菌的氣生菌絲；C，矮小芽胞桿菌4 ℃生長菌落；D，阿薩希毛孢子菌腦回樣菌落。

圖6 菌落形態(tài)

菌落拍攝難度要大于鏡下拍攝，尤其是那些小菌落、凹陷菌落、擴散生長菌落、絨毛樣菌落等，自動拍攝很難準確對焦，拍攝時需要運用到很多攝影技術與技巧，加以長期的訓練才能拍攝自如，相應的拍攝裝置也應運而生。開放式菌落拍攝只需有足夠的光線就可以拍攝，其缺點是無法控制污染;半封閉式菌落拍攝裝置，可控制光源，拍攝完成后只需進行局部消毒處理，但也無法完全避免污染；封閉式菌落拍攝裝置完全符合生物安全需要，不僅有封閉艙門、內置可調節(jié)燈光、防反射光板及拍攝角度調節(jié)板，兼容手機、相機和圖像采集器，而且內設紫外燈管，可隨時消毒，見圖7。

注：A，開放式菌落拍攝裝置；B，半封閉式菌落拍攝裝置；C，封閉式菌落拍攝裝置。

圖7 菌落拍攝裝置

2.4純菌體鏡下形態(tài)拍攝

2.4.1細菌鏡下拍攝 要注意選擇菌量適中、染色良好、具有典型形態(tài)特征的視野進行，對菌體特殊結構的拍攝要求充分體現(xiàn)出具體特征，如齲齒羅氏菌菌體末端膨大(見圖8)、丹毒絲菌菌體呈長鏈狀排列、芽胞的形狀及在菌體中的位置及染色特性等(建議在相差顯微鏡下直接拍攝芽胞，其效果好于芽胞染色)、細菌莢膜的厚度及著色情況、鞭毛的位置和數(shù)量等(細菌的鞭毛很細，非?？简炁臄z水平，要認真對焦，否則很難拍攝成功)。

圖8 齲齒羅氏菌革蘭染色(×1 000)

2.4.2真菌鏡下拍攝 真菌鏡下拍攝也分為不染色和染色2種情況。不染色主要是拍攝真菌自然的生長狀態(tài)，如對菌落的直接鏡下拍攝(見圖9)、對小培養(yǎng)的直接鏡下拍攝及對假絲酵母菌血清芽管試驗的鏡下拍攝等。染色標本主要是對絲狀真菌乳酸酚棉藍染色后的鏡下形態(tài)和對非絲狀真菌的革蘭染色鏡下形態(tài)拍攝。拍攝時最好選擇各種典型特征匯聚在一起或具有特征性的視野進行拍攝(見圖10)。

圖9 不染色菌體拍攝(黑曲霉，×100)

圖10 互隔鏈格孢乳酸酚棉藍染色(×400)

由于真菌個體較大，拍攝時要注意景深，選擇合適的物鏡頭很重要，不同焦距面都要拍下來(見圖11)，能夠清晰地顯示菌絲、足細胞、孢子梗、囊托、分生孢子等。要拍攝出絲狀真菌的典型生長狀態(tài)，最好是選擇小培養(yǎng)制片方法。

圖11 不同焦距連續(xù)拍攝(根霉，×100)

2.5生化反應及輔助試驗結果的拍攝 生化反應及輔助試驗結果拍攝并不比菌落的拍攝容易，根據(jù)不同的試驗結果需要使用不同的拍攝技術。比如拍CAMP和半固體動力試驗結果時選用逆光的效果最佳，拍攝熒光素檢測結果和紫外線吸收試驗結果時要用紫外光線等。

2.6藥敏試驗及耐藥機制檢測結果的拍攝 拍攝需要用肉眼判斷結果的藥敏試驗及耐藥機制檢測結果時，必須能夠在圖片中如實反映出結果的細節(jié)部分，使讀者能夠根據(jù)圖片也能準確判定結果。如應注意藥敏試驗結果中的弱生長現(xiàn)象，耐藥機制檢測試驗結果中的抑菌圈邊緣試驗(見圖12)、協(xié)同或抑制試驗等。

注：A，沙灘樣；B，懸崖樣。

圖12 抑制圈邊緣試驗結果

3 臨床微生物圖片拍攝技巧

3.1色彩還原準確 色彩還原準確指拍攝的彩色圖片的色彩，大體上和原景物的色彩相一致。影響色彩還原的因素有相機的性能、白平衡的設置、攝影鏡頭的質量、光線的色溫等，自然光能最好地還原圖像的真實色彩。

3.2比例尺 要準確地反映被拍攝物體的真實大小，最簡單有效的辦法就是在圖片上標明比例尺。有些專用的相機及顯微鏡配有比例尺，但一般的設備不具備，也可通過目鏡測微尺加以標示(見圖13)。這就要求拍攝者在拍攝時注意記錄拍攝時的放大倍數(shù)，當然不只是物鏡乘以目鏡放大倍數(shù)這么簡單，實際上還需要注意相機變焦及圖片后處理時的裁剪等因素，總之要盡可能準確，并在圖片中注明放大倍數(shù)。

圖13 目鏡測微尺

3.3光線運用 攝影就是光的藝術，不會用光是拍不出好的作品。尤其是對菌落的拍攝，應該根據(jù)菌落實際的特征以及拍攝者要反映出的效果來選擇用光，側光(見圖14)和逆光(見圖15)也是常用的手段，運用好能拍出極佳的效果。

注：A，青霉菌黏液珠；B，芽胞桿菌。

圖14 側光拍攝效果

注：A,反射光拍攝；B，透射光(逆光)拍攝。

圖15 伴放線聚集桿菌菌落拍攝效果

4 臨床微生物檢驗圖片拍攝注意事項

4.1對拍攝者的健康要求 拍攝者的體檢結果應符合醫(yī)學檢驗從業(yè)人員的體檢標準[6]，色盲、色弱者不適合進行彩色圖片的拍攝工作。

4.2保證圖片質量 一張合格的圖片應該是圖像清晰、色彩逼真、主題突出、背景干凈、像素符合要求。圖像清晰主要是要求對焦和曝光準確、防顫抖，色彩逼真要求拍攝輔助光接近自然光、適時調準白平衡，主題突出就是要把最具典型特征的部位放在醒目位置，必要時加箭頭指示。拍攝菌落和其他輔助試驗時是要注意保持背景干凈，避免出現(xiàn)窗戶、門框、桌椅等，平板背面盡量不要用記號筆寫字，否則影響觀察菌落的顏色、溶血等特征。

4.3生物安全 所有拍攝過程均要符合實驗室生物安全要求。拍攝菌落最好在生物安全柜中進行，攝影器材不要帶出實驗室，圖片可通過實驗室電腦進行傳輸。如果使用手機進行拍攝，最好是實驗室配置的專用手機，個人的手機嚴禁帶入實驗室。

4.4興趣培養(yǎng)與技能訓練 建議拍攝者日常多在自然狀態(tài)下進行拍攝訓練，尤其是對微距拍攝的訓練，如拍攝花、鳥、魚、蟲等小的景物，既可培養(yǎng)興趣，又可以將實戰(zhàn)技巧運用于實際工作中來，拍出用于日常工作、學習交流、發(fā)表論文等更好的圖片。

[1]陳東科. 加強形態(tài)學檢查提高細菌鑒定的準確性[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學, 2012, 30(5): 419-421.

[2]中國醫(yī)師協(xié)會檢驗醫(yī)師分會感染性疾病檢驗醫(yī)學專家委員會. 臨床微生物檢驗診斷報告模式專家共識[J]. 中華醫(yī)學雜志，2016，96(12)：937-939.

[3]魏蓮花，鄒鳳梅，劉剛，等. 臨床微生物形態(tài)學及特殊耐藥性檢測室間質量評價體系的建立及應用[J]. 臨床檢驗雜志，2017,35(7)：538-541.

[4]陳東科，孫長貴．實用臨床微生物學檢驗與圖譜[M]. 第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

[5]美國紐約攝影學院. 美國紐約攝影學院攝影教材[M]. 北京：中國攝影出版社，2010.

[6]中國合格評定國家認可委員會. CNAS-CL42:醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在臨床微生物學檢驗領域的應用說明[S/OL]. 2012：3(2015-11-11)[2017-09-05]. https://www.cnas.org.cn/images/rkgf/sysrk/rkyyzz/2015/12/21/64DBFD05D574C2DD479FDB6E82F75FAF.pdf.

2017-05-15)

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.03

陳東科，1961年生，男，副主任技師，擅長微生物形態(tài)學檢查與圖片拍攝。

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