劉曙光，章思思，邵牧民，馬紅梅，申 洪

miR-200a對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響

劉曙光1，章思思2，邵牧民3，馬紅梅1，申 洪2

目的探討miR-200a在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對A549細(xì)胞增殖、遷移及凋亡等生物學(xué)功能的影響。方法采用RT-PCR檢測肺癌細(xì)胞株A549、H23、H460和永生化人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE的表達(dá)水平。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-200a mimics和陰性對照序列(miR-negtive control, miR-NC)分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力的改變情況；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-200a的靶基因。結(jié)果miR-200a在肺癌細(xì)胞株A549、H23和H460相對表達(dá)水平均低于16HBE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-200a mimics和miR-NC組分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示miR-200a mimics組在第4、5天時的OD值明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示miR-200a mimics組細(xì)胞克隆形成率為(33.13±0.74)%，明顯少于miR-NC組(45.57±1.27)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，miR-200a mimics穿膜細(xì)胞數(shù)為(71.60±17.90)個，少于miR-NC組[(140.20±17.88)個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，miR-200a mimics凋亡率為(17.80±1.90)%，明顯高于miR-NC組[(11.33±1.96)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。生物信息學(xué)方法預(yù)測Tiam1等可能是miR-200a的靶基因。結(jié)論miR-200a能夠抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖、遷移并促進(jìn)其凋亡，為肺癌的治療提供潛在靶點(diǎn)。miR-200a可能通過靶基因Tiam1發(fā)揮其對腫瘤的調(diào)控作用。

肺腫瘤；miR-200a；A549細(xì)胞；增殖；遷移；凋亡

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率和病死率均占全球首位，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌的80%。NSCLC發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程，涉及眾多基因和蛋白。miRNA是一類非編碼微小RNA，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，通過其靶基因和多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抑癌或促癌作用。目前，有關(guān)miR-200a在NSCLC中功能的研究鮮有報道。因此本實(shí)驗(yàn)通過分析miR-200a對肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為NSCLC的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料人NSCLC細(xì)胞株A549、H23、H460和永生化人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE均來自南方醫(yī)科大學(xué)病理系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。PRIM 1640、胎牛血清FBS及胰蛋白酶(HyClone公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)；轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)；miR-200a mimics、隨機(jī)陰性對照RNA(上海吉瑪生物公司)；RT-PCR檢測試劑盒(全式金公司)；TRIzol(Takara公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；Transwell小室(Corning公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞選用PRIM 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況每2～3天換液培養(yǎng)1次，當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底壁大部分表面時，進(jìn)行細(xì)胞傳代或收集細(xì)胞。將生長狀態(tài)穩(wěn)定的A549細(xì)胞[細(xì)胞數(shù)(4～5)×105個]接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照Lipofectamine RNAiMax說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染miR-200a mimics為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染miRNA negative control(miR-NC)作為陰性對照組，轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miR-200a mimics序列：5′-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3′；3′-AUCGUU ACCAGACAGUGUUAUU-5′；miR-NC序列：5′-CAG UACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.2.2RT-PCR檢測不同細(xì)胞株中miR-200a表達(dá) 采用RNA 抽提試劑盒抽提各細(xì)胞株中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACACATCGTT-3′。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA保存于-80 ℃冰箱中備用。定量PCR上游引物：5′-CATGACACTGTCTGGTAAC-3′；下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中包括miR-PCR primers 2 μL、2×SYBR Mix 10 μL、miRNA RTproduct 2.0 μL、Rox 0.1 μL、蒸餾水5.9 μL。以U6為內(nèi)參，所測定的miR-200a的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.3CCK-8檢測A549細(xì)胞的增殖能力 具體操作參照CCK-8 試劑盒說明書進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染24 h的A549細(xì)胞以每孔(1～2)×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 μL，設(shè)空白對照(僅加培養(yǎng)基)；分別培養(yǎng)1、2、3、4、5天。每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后終止培養(yǎng)，以空白對照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀上450 nm 測定各孔吸光度值(OD值)，以相對應(yīng)OD值表示細(xì)胞增殖能力的大小。各組取3 孔平均值，繪制增殖曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4平板克隆實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組細(xì)胞接種在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞200個(每孔加培養(yǎng)液2 mL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2周。密切觀察細(xì)胞的生長情況，2 周時出現(xiàn)肉眼可見的集落形成，即可終止培養(yǎng)。移除培養(yǎng)液，加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞3次，再用4%的多聚甲醛固定10 min，然后用吉姆薩染色法染色20 min，置于空氣中干燥。計數(shù)細(xì)胞克隆。

1.2.5Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 采用24孔板，每孔加入600 μL RPMI 1640+10 %FBS培養(yǎng)基后放入Transwell小室。轉(zhuǎn)染24 h后將miR-200a mimics組、miR-NC組細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，吹打成單細(xì)胞懸液，并以每孔200 μL 有1×104個細(xì)胞接種于Transwell小室上層，每組設(shè)置3個復(fù)孔，48 h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次。4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，蘇木精染色，30 min后，流水清洗培養(yǎng)板。計數(shù)，拍照，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率 轉(zhuǎn)染48 h后消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)1 200 r/min 離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，用500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V，加入10 μL的PI?；靹蚝笫覝乇芄夥跤? min，立即上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4hsa-miR-200a靶基因預(yù)測miR-200a潛在靶基因應(yīng)用miRWalk綜合數(shù)據(jù)庫(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)進(jìn)行預(yù)測，并取其中Targetscan、miRanda、RNAhybrid、miRWalk和Microt4共5種工具計算基因交集。

2 結(jié)果

2.1miR-200a在肺癌細(xì)胞株和正常支氣管上皮細(xì)胞株中的表達(dá)RT-PCR檢測肺癌細(xì)胞株及永生化人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE中miR-200a的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-200a在3種肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)均明顯低于16HBE(P均<0.05)。其中以A549細(xì)胞中miR-200a的表達(dá)水平最低，因此選取A549細(xì)胞株作為進(jìn)一步分析對象(圖1)。

圖1 miR-200a在不同細(xì)胞株中的相對表達(dá)水平

2.2miR-200a對A549細(xì)胞增殖的影響以吸光度為縱坐標(biāo)、時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。肉眼觀察并記錄克隆斑數(shù)目，計算克隆形成率，克隆形成率=(克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。CCK-8法檢測A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200a mimics、miR-NC后1～5天的OD值，并繪制生長曲線。結(jié)果顯示：與miR-NC組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-200a mimics細(xì)胞的OD值在4、5天時均降低(圖2)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示miR-200a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成率為(33.13±0.74)%，明顯少于miR-NC組[(45.57±1.27)%]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-200a mimics后A549細(xì)胞生長曲線

圖3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A.miR-NC組；B.miR-200a mimics組；C.克隆形成率

2.3miR-200amimics對A549細(xì)胞遷移能力的影響Transwell細(xì)胞體外遷移能力檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200a mimics穿膜細(xì)胞數(shù)為(71.60±17.90)個/孔，少于miR-NC組[(140.20±17.88)個/孔]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.4miR-200amimics對A549細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48 h后兩組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示，miR-200a mimics和miR-NC組的細(xì)胞凋亡率分別為(17.80±1.90)%和(11.33±1.96)%，miR-200a mimics組的細(xì)胞凋亡率明顯高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

A.miR-NC組；B.miR-200a mimics組；C.細(xì)胞凋亡率

2.5miR-200a靶基因的預(yù)測利用miRWalk綜合數(shù)據(jù)庫，并取其中Targetscan、miRanda、RNAhybrid、miRWalk和Microt4共5種數(shù)據(jù)庫的計算結(jié)果取其交集，所得部分靶基因詳見表1。選擇其中1個潛在靶基因Tiam1利用TargetScan、DIANA-microT和miRanda常用數(shù)據(jù)庫反向預(yù)測Tiaml相互作用的miRNAs，結(jié)果顯示miR-200a可做為候選miRNA。TargetScan 數(shù)據(jù)庫顯示miR-200a與Tiaml的3’UTR區(qū)以不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合。因此，我們推測Tiaml可作為miR-200a的靶基因進(jìn)行下一步分析。

表1 利用miRWalk預(yù)測所得miR-200a的部分靶基因

3 討論

miRNA是大小為17～25個堿基的單鏈非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，通過與靶mRNA3’UTR的序列特異性結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯抑制，出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。預(yù)測分析約30%的人類蛋白編碼基因包括多種癌基因和抑癌基因受miRNA的調(diào)控。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移及治療等方面具有重要作用[1]。由于miRNA在外周血、尿中穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，且在石蠟標(biāo)本也可提取，提示miRNA可作為腫瘤標(biāo)志物以及腫瘤治療靶點(diǎn)的潛能。miRNA與NSCLC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移也有密切關(guān)系，如miR-182[2]、miR-200[3]、miR-145[4]等可抑制NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，積極探尋抑癌miRNA在NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制是當(dāng)前肺癌研究熱點(diǎn)。

miR-200a作為miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-114、miR-429)中的一員，定位于人1號染色體1p36.33。miR-200家族中的5個成員具有高度相似的種子序列，根據(jù)5’末端種子序列的相似性，將miR-200家族分為miR-200a/141和miR-200b/c/429兩個亞族。近年miR-200家族被認(rèn)為能調(diào)控上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，并且在某些腫瘤中表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等[5]在對肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-200a 在肝癌中表達(dá)下調(diào)，通過靶基因GAB1抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲；miR-200a可靶向TFAM抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[6]。此外，在胃癌[7]、胰腺導(dǎo)管腺癌[8]、腎細(xì)胞癌[9]等腫瘤中也有類似作用。但在少數(shù)腫瘤中miR-200a也會表達(dá)上調(diào)，如miR-200a在結(jié)直腸中表達(dá)上調(diào)，通過靶基因PTEN促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[10]；miR-200a在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中高表達(dá)，在細(xì)胞株HEC-1B中下調(diào)miR-200a可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡[11]?？梢?，miR-200a在不同腫瘤組織中的表達(dá)及作用部分有類似。目前，miR-200a在肺癌中的研究較少。Zhen等[12]發(fā)現(xiàn)miR-200a在肺癌細(xì)胞株表達(dá)低于正常肺上皮細(xì)胞株，過表達(dá)miR-200a可通過下調(diào)EGFR和c-MET抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲。miR-200a在肺腺癌H1299細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于人肺小氣道上皮細(xì)胞SAEC細(xì)胞，在轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞株中，miR-200a對多個癌基因具有抑制作用[13]。另有研究顯示，miR-200家族中miR-200a和miR-200c在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于永生化上皮細(xì)胞HBE[14]，本組結(jié)果支持上述部分結(jié)論。然而，miR-200a在肺癌細(xì)胞中的功能及作用機(jī)制仍不明確，本組通過轉(zhuǎn)染成熟體miR-200a mimics序列，上調(diào)miR-200a的表達(dá)，并對A549細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，A549細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞克隆率明顯減少，細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)減少，表明miR-200a可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-200a表達(dá)后，A549細(xì)胞的凋亡率顯著提高，以上結(jié)果表明miR-200a在肺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)凋亡，提示hsa-miR-200a有可能作為肺癌治療的新靶點(diǎn)。為進(jìn)一步探討miR-200a影響A549細(xì)胞增殖和遷移作用機(jī)制，本課題組從生物信息網(wǎng)站(TargetScan等)預(yù)測并篩選出Tiam1基因。Tiam1屬于鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子家族成員，可調(diào)節(jié)Rho家族的小G蛋白。目前研究認(rèn)為Tiaml主要通過選擇性激活Rac下游信號通路，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)連接細(xì)胞外信號與細(xì)胞骨架的通訊，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等。我們前期研究[15]證實(shí)Tiaml在肺腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)不僅與患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其還是影響肺腺癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。文獻(xiàn)已證實(shí)，miR-200家族另一成員miR-141在肝癌中與Tiam1存在特異性結(jié)合[16]，miR-200a在肺癌中的直接作用靶基因是否是Tiam1，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

miR-200a不僅調(diào)控靶基因的表達(dá)，還受到上游基因、轉(zhuǎn)錄因子及表觀遺傳等的調(diào)控。需要強(qiáng)調(diào)的是，miR-200a與其調(diào)控的靶點(diǎn)mRNA并非一對一的關(guān)系，兩者之間形成一個復(fù)雜和相互關(guān)聯(lián)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR-200a的改變能引起一連串級聯(lián)反應(yīng)和反饋通路，涉及多個mRNA和影響多個信號通路的靶基因。文獻(xiàn)報道m(xù)iR-200a作用于SIP1、ZEB1、ZEB2、SIRT1、TFAM等靶基因mRNA的3’UTR，參與EMT過程的調(diào)節(jié)，從而增加腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。另一方面miR-200a還可通過Wnt/β-catenin[17]、NF-κB[18]等信號通路參與腫瘤的進(jìn)展。由于miR-200a可以靶向多種基因，除少數(shù)靶基因已得到鑒定外，miR-200a還存在其他未被認(rèn)知的靶基因和作用機(jī)制。本課題組擬進(jìn)一步驗(yàn)證miR-200a的靶基因，并探討其表達(dá)的機(jī)制與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，為肺癌的治療提供新的思路和治療靶點(diǎn)。

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EffectofmiR-200aontheproliferation,migrationandapoptosisoflungcancercelllineA549

LIU Shu-guang1, ZHANG Si-si2, SHAO Mu-min3, MA Hong-mei1, SHEN Hong2

(1DepartmentsofPathology,theEighthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Shenzhen518033,China;2DepartmentofPathology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;3DepartmentsofPathology,ShenzhenHospitalAffiliatedtoGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Shenzhen518033,China)

PurposeTo investigate the expression of miR-200a in different lung cancer cell lines and its effect on proliferation, migration, and apoptosis in A549 cells.MethodsThe expressions of miR-200a in different lung cancer cell lines were detected by RT-PCR. miR-200a mimics was transfected into A549 cells by Lipofectamine RNAiMax. The change of proliferation ablility of A549 cells was detected by CCK-8 method and plate clone formation assay. Cell migration was examined by Transwell chamber assay. The flow cytometry was used to examine the changes of apoptosis. The possible target genes of miR-200a were forecasted by bioinformatics tools.ResultsThe results of RT-PCR showed that the expression of miR-200a was significantly down-regulated in A549, H23 and H460 cell lines than 16HBE cell line. CCK-8 assay showed that the OD values of the mimics group at 4, and 5 days were significantly lower than those in the negative control (NC) group (P<0.05). Plate clone formation assay showed rate of colony formation in the mimics group was significantly lower than that in the NC group [(33.13±0.74)%vs(45.57±1.27)%,P<0.05]. Transwell migration assay showed that the cell number of mimics group that passed the Transwell membrane was significantly lower than that of the NC group [(71.60±17.90)vs(140.20±17.88),P<0.05]. Flow cytometry showed that the apoptosis rate of the mimics group was significantly higher than that of the NC group [(17.80±1.90)%vs(11.33±1.96)%,P<0.05]. Tiam1 may be one of the target gene of miR-200a.ConclusionmiR-200a can inhibit the proliferation and migration, and promote apoptosis of lung cancer A549 cells, suggesting a potential new therapeutic agent for lung cancer cell. MiR-200a may play a function of regulation of tumor development through target gene Tiam1.

lung neoplasm； miR-200a； A549 cells； proliferation； migration； apoptosis

時間：2017-9-18 6:23 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.011.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)09-0992-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.011

接受日期：2017-06-30

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助(A2015429、A2016114)、深圳市福田區(qū)衛(wèi)生公益性科研項(xiàng)目(FTWS2015017)

1中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院病理科，深圳 518033

2南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，廣州 510515

3廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳附屬醫(yī)院病理科，深圳 518033

劉曙光，男，博士，副主任醫(yī)師。E-mail: SGL3016@163.com

申 洪，男，教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: shenhong2010168@163.com