馬曉龍，李紅威，劉從容，王 華

一種新型快速組織處理技術(shù)在病理標(biāo)本處理中的應(yīng)用

馬曉龍1，李紅威2，劉從容1，王 華1

新型；快速組織處理；病理標(biāo)本

目前，國(guó)內(nèi)大部分醫(yī)院病理科仍采用傳統(tǒng)方法處理常規(guī)病理標(biāo)本，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)8～14 h，基本能滿(mǎn)足日常病理診斷的需要[1-2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)院規(guī)模不斷擴(kuò)大、病理科標(biāo)本量增多、病床周轉(zhuǎn)率逐漸增高的現(xiàn)象日趨凸顯，病理診斷報(bào)告發(fā)放速度需隨之加快，這就需要縮短標(biāo)本處理時(shí)間[3-4]。因此，有些快速組織處理方法也逐漸被多家病理科應(yīng)用到常規(guī)工作中。本科室在實(shí)踐工作摸索出一種新型快速全自動(dòng)組織脫水機(jī)聯(lián)合使用Fast Flex快速組織處理試劑的方法，可在2～4 h內(nèi)通過(guò)4個(gè)步驟自動(dòng)完成病理標(biāo)本的處理。為全面評(píng)估這種新型快速組織處理技術(shù)的效果，同時(shí)采用新型快速組織處理方法和傳統(tǒng)組織處理方法，對(duì)不同類(lèi)型組織在形態(tài)學(xué)、免疫組化及基因檢測(cè)等方面進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料收集北京大學(xué)第三醫(yī)院2013～2014年手術(shù)切除的病理標(biāo)本45例，包括皮膚、扁桃體、甲狀腺、乳腺、肺、胃、結(jié)腸、肝臟、前列腺、輸卵管、子宮及尸檢腦組織，采用傳統(tǒng)常規(guī)組織處理方法完成整個(gè)流程，留取存檔冷凍組織庫(kù)中部分組織、采用快速處理程序進(jìn)行處理。

1.2儀器(1)Tissue-Tek VIP6組織脫水機(jī)(Sakura)；(2)STP420ES新型自動(dòng)組織脫水機(jī)(Thermo)；(3)全自動(dòng)HE染色機(jī)(Leica ST5010)；(4)全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)(Benchmark XT，羅氏)；(5)Nanodrop DNA定量測(cè)定儀(Thermo)；(6)Real time-PCR儀(Qiagen，Agilent)。

1.3方法

1.3.1組織處理 大標(biāo)本取材大小為2.0 cm×1.5 cm×0.2/0.3 cm[5]，合計(jì)33例。模擬穿刺組織(長(zhǎng)1 cm，直徑約0.16 cm)及小活檢標(biāo)本(直徑0.2～0.4 cm)合計(jì)12例。常規(guī)組標(biāo)本采用10%中性福爾馬林固定6～24 h，快速組標(biāo)本用Fast Flex Holding Solution固定2 h，分別在不同脫水機(jī)中使用常規(guī)試劑和Fast Flex快速組織試劑處理標(biāo)本，其中快速組標(biāo)本在不同溫度條件下依次通過(guò)3種快速脫水試劑及快速石蠟制劑，大標(biāo)本處理時(shí)間為162 min，小標(biāo)本處理時(shí)間為120 min。最后采用Leica石蠟包埋組織，4 μm厚切片，分別行HE染色及免疫組化染色。

1.3.2免疫組化 選擇18種常用一抗，陽(yáng)性著色部位包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。其中，HER-2、E-cadherin、CD20、CD38、CD3、CD117、CD99均為細(xì)胞膜著色；CK(AE1/AE3)、CK5/6、CK7、CK20、CK34βE12、CD68、SMA均為細(xì)胞質(zhì)著色；ER、Ki-67、TTF-1、CDX-2均為細(xì)胞核著色?？贵w分別購(gòu)自DAKO、Leica及北京中杉金橋公司。除HER-2染色采用免疫組化自動(dòng)染色機(jī)，其余均采用EnVision兩步法進(jìn)行手工染色。陽(yáng)性對(duì)照選用相應(yīng)一抗陽(yáng)性組織切片，TBS替代一抗作為空白對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷

1.4.1HE染色評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) (1)按著色強(qiáng)度評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：深染為3分、中等染色為2分、淺染色為1分；(2)按細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜著色對(duì)比度評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：清晰為3分、部分清晰為2分、不清晰為1分；(3)按組織結(jié)構(gòu)完整性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：完整為3分、部分完整為2分、不完整為1分；(4)按細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：完整為3分、部分完整為2分、不完整為1分。4項(xiàng)得分相加為HE染色效果總分，滿(mǎn)分為12分[6]。

1.4.2免疫組化染色評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行評(píng)判；陽(yáng)性信號(hào)為著色部位出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒。(1)按陽(yáng)性信號(hào)定位的準(zhǔn)確性判斷： 90%～100%陽(yáng)性信號(hào)定位準(zhǔn)確為3分、50%～89%信號(hào)定位準(zhǔn)確為2分、<50%信號(hào)定位準(zhǔn)確為1分；(2)按陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度判斷：棕褐色為3分、棕黃色為2分、淡黃色為1分、無(wú)著色為0分；(3)按陽(yáng)性細(xì)胞比例判斷：>50%為3分、10%～50%為2分、<10%為1分、無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分；三項(xiàng)相加作為該切片評(píng)分值，其中HER-2判讀標(biāo)準(zhǔn)參照《乳腺癌 HER-2檢測(cè)指南(2014版)》[7]。

1.5石蠟包埋組織DNA提取、熒光Realtime-PCR法檢測(cè)基因突變45例組織標(biāo)本中選取病理診斷為非小細(xì)胞肺癌1例及結(jié)腸癌2例，10 μm厚石蠟切片5～10片，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)試劑盒、按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。采用Nanodrop 1000定量測(cè)定儀測(cè)定樣本DNA純度和濃度。采用QIAGEN公司的EGFR RGQ PCR檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因18、19、20及21外顯子中的29種突變。采用艾德公司ADx-ARMS-Kras檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)腸癌KRAS基因突變。每批反應(yīng)均同時(shí)設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熒光信號(hào)曲線(xiàn)及閾值線(xiàn)判讀檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1HE染色大組織：常規(guī)組HE染色各項(xiàng)得分均為3分，總平均分為12分；快速組總平均分為11.93分，其中HE染色強(qiáng)度平均3分、細(xì)胞核質(zhì)對(duì)比度平均3分、組織結(jié)構(gòu)完整性平均3分、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性平均2.93分；快速組中少數(shù)標(biāo)本(3/45)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)稍欠清晰，但不影響病理組織學(xué)診斷。穿刺及小組織：快速組與常規(guī)組平均分均為12分?？焖俳M處理的組織無(wú)論大小，其各項(xiàng)指標(biāo)與常規(guī)組相比均無(wú)明顯差異(圖1、2)。

2.2免疫組化染色18種免疫組化抗體分別用于相應(yīng)組織染色中，部分組織分別使用1～5種抗體，快速組和常規(guī)組各配套著染96張切片?？焖俳M中各項(xiàng)免疫組化指標(biāo)染色陽(yáng)性定位準(zhǔn)確，背景清晰，與常規(guī)組相比，兩組得分具有明顯正相關(guān)，其陽(yáng)性著色部位、陽(yáng)性強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例均無(wú)明顯差別(圖3～6)。

2.3基因突變檢測(cè)常規(guī)組和快速組中均檢測(cè)到一致性的基因突變，即1例肺癌標(biāo)本中檢測(cè)到EGFR基因Exon-19缺失突變、Exon-20 T790M點(diǎn)突變(圖7)，2例腸癌標(biāo)本中分別檢測(cè)到KRAS基因第2外顯子Codon-12中Gly12Val突變和Gly12Ala突變。

3 討論

組織脫水機(jī)的容量和速度是加快大量病理標(biāo)本處理的關(guān)鍵。新型STP420ES自動(dòng)組織脫水機(jī)的容量較大，并且根據(jù)組織大小不同，設(shè)有主缸和副缸，主缸有360個(gè)包埋盒，主要用于大標(biāo)本處理，副缸有60個(gè)包埋盒，可處理小活檢及穿刺標(biāo)本；主、副缸程序可同時(shí)或單獨(dú)運(yùn)行。由于大、小標(biāo)本分開(kāi)處理，使脫水機(jī)的運(yùn)行效率在保證各種組織充分脫水的同時(shí)得到明顯提高。更具特色的是，主反應(yīng)缸的運(yùn)行方式為滾筒式攪拌，可促進(jìn)新鮮液體在組織周?chē)鲃?dòng)，通過(guò)旋轉(zhuǎn)方式定時(shí)交換化學(xué)試劑，使試劑與組織交換面積及效率較常規(guī)流程明顯提高，有效縮短標(biāo)本的處理時(shí)間[8]。此外，該設(shè)備同時(shí)使用Fast Flex快速反應(yīng)試劑，進(jìn)一步加快脫水速度，整個(gè)標(biāo)本處理時(shí)間由常規(guī)的8～12 h減少到2～4 h，使制片時(shí)間及后續(xù)病理報(bào)告發(fā)放周期明顯縮短，為需要進(jìn)行特殊治療如靶向治療的患者贏(yíng)得寶貴的治療時(shí)間。

本組采用快速組織處理技術(shù)制備的小活檢組織及穿刺組織，其HE染色效果較好，組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，與常規(guī)組處理的效果無(wú)明顯差異。在小標(biāo)本的取材方面，為了達(dá)到與實(shí)際工作相符合的效果，首次采用模擬穿刺組織和小活檢標(biāo)本取材方法，這在以往研究中未見(jiàn)報(bào)道。多數(shù)大組織的切片染色效果與常規(guī)組無(wú)明顯差異，但少數(shù)大組織在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性上略有差異，可能與試劑在短時(shí)間內(nèi)對(duì)于大標(biāo)本的固定和穿透性欠佳有關(guān)，這些組織通過(guò)適當(dāng)改進(jìn)HE染色[9]，可以達(dá)到與常規(guī)組類(lèi)似的效果。因此，在使用這套設(shè)備及試劑時(shí)，需根據(jù)組織類(lèi)別、大小，適當(dāng)調(diào)整染色細(xì)節(jié)，以確保組織處理的效果和質(zhì)量；并應(yīng)該嚴(yán)格界定標(biāo)本的取材厚度不超過(guò)3 mm，這也是保證標(biāo)本處理效果的前提。

①②③④⑤⑥

圖1常規(guī)組肝臟組織HE染色圖2快速組肝臟組織HE染色圖3常規(guī)組乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中E-Cadherin呈陽(yáng)性，EnVision兩步法

圖4快速組乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中E-Cadherin呈陽(yáng)性，EnVision兩步法圖5常規(guī)組乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中ER呈陽(yáng)性，EnVision兩步法圖6快速組乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中ER呈陽(yáng)性，EnVision兩步法

圖7 EGFR基因檢測(cè)：EGFR基因Exon-19缺失突變、Exon-20 T790M點(diǎn)突變

在免疫組化染色效果的評(píng)定方面，本組實(shí)驗(yàn)選用病理外檢工作中常用的抗體，這些抗體著染部位包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)快速組處理的組織無(wú)論從著色部位、著色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例上，與常規(guī)組均無(wú)明顯差異，提示快速組織處理技術(shù)亦能夠較好地保存細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)抗原。在基因突變檢測(cè)方面，快速組能夠檢測(cè)到與常規(guī)組一致的基因突變，提示快速組織處理技術(shù)能夠較好地保存細(xì)胞內(nèi)的核酸。

綜上所述，本組實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)、免疫組化染色及基因檢測(cè)對(duì)新型快速組織處理技術(shù)處理的組織進(jìn)行較全面的評(píng)估，結(jié)果顯示該項(xiàng)技術(shù)在組織處理速度和效率方面有一定的優(yōu)勢(shì)，且不影響抗原表達(dá)和核酸分析；但需要指出的是，本實(shí)驗(yàn)僅用少量標(biāo)本進(jìn)行測(cè)試，考慮到同樣試劑容量處理標(biāo)本時(shí)，小樣本量的處理效果可能要優(yōu)于大樣本量。目前，該項(xiàng)快速組織處理技術(shù)的效果尚需進(jìn)一步實(shí)踐證明。

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時(shí)間：2017-9-18 6:23 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.028.html

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10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.028

接受日期：2017-07-09

1北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系/北京大學(xué)第三醫(yī)院病理科，北京 100191

2北京市垂楊柳醫(yī)院病理科，北京 100022

馬曉龍，男，主管技師。E-mail: maxiaolong1998@sina.com

王 華，女，副教授，通訊作者。E-mail: hxwanghua@aliyun.com