李永輝，王勇，田建平，高炳淼，張俊清*

(1.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

·中藥農(nóng)業(yè)·

海南白沙縣青松鄉(xiāng)人工栽培益智種質(zhì)資源的調(diào)查與分析△

李永輝1，2，王勇1，2，田建平2，高炳淼2，張俊清1，2*

(1.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 海口 571199)

目的對(duì)海南白沙縣青松鄉(xiāng)栽培的益智種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查，對(duì)3個(gè)主要益智種質(zhì)資源的外觀形態(tài)和次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為益智優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源選育提供基礎(chǔ)。方法測(cè)量益智不同種質(zhì)資源葉片的長(zhǎng)度和寬度，稱量益智不同種質(zhì)資源的果實(shí)粒重，用LC-MSMS分析不同種質(zhì)資源果實(shí)中次生代謝產(chǎn)物的含量。結(jié)果不同益智質(zhì)資源的葉片長(zhǎng)寬度、果實(shí)粒重和次生代謝產(chǎn)物含量間具有明顯差異，以圓果益智的質(zhì)量最佳。結(jié)論益智不同種質(zhì)資源的外觀形態(tài)和次生代謝產(chǎn)物含量差異較大，圓果益智為優(yōu)質(zhì)品種，建議推廣種植。

益智，種質(zhì)資源，形態(tài)，次生代謝產(chǎn)物

益智AlpiniaoxyphyllaMiq.為姜科多年生草本植物，以果實(shí)入藥，別名益智子、智仁及摘艼子，為歷版《中華人民共和國(guó)藥典》所收載[1]。具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾之功效[2]。

益智在我國(guó)有著悠久的栽培歷史，晉代《南方草木狀》[3]曰：“出交趾合浦。建安八年，交州刺史張津嘗以益智粽餉魏武帝”。北宋《本草圖經(jīng)》[5]記載“益智子，生昆侖國(guó)。今嶺南州郡往往有之”?！稏|坡雜記》記載“海南產(chǎn)益智，花實(shí)皆作長(zhǎng)穗而分三節(jié)，其實(shí)熟否，以侯歲之豐歉”，由此可見(jiàn)自晉代以來(lái)益智主產(chǎn)于我國(guó)兩廣地區(qū)。隨著社會(huì)發(fā)展和氣候的變化，益智的適宜生存環(huán)境越來(lái)越縮減，目前在海南的瓊中、白沙、保亭等海拔400m以上的山區(qū)有大量栽培，全國(guó)90%的藥用益智產(chǎn)自海南省。野生益智零散分布于海南省山區(qū)，存在較多居群，其葉、果實(shí)等原植物外形差異較大，生物多樣性復(fù)雜[3-4]。在益智的人工栽培種植和優(yōu)選過(guò)程中，益智的原植物外形逐漸向一致性轉(zhuǎn)化。當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)根據(jù)益智不同種質(zhì)資源的生長(zhǎng)期青果形態(tài)，分別命名為圓果益智、橢圓果益智和小果益智，其中圓果益智的青果呈近圓形，果實(shí)較大；橢圓果益智的青果呈橢圓形或紡錘形，果實(shí)大小居于其它兩種益智之中；小果益智青果果實(shí)最小，不同益智種質(zhì)資源的青果外形見(jiàn)圖1。

注：A.圓果益智、B.橢圓果益智、C.小果益智圖1 三種不同益智栽培種質(zhì)資源的果實(shí)外觀圖

作者在益智的栽培種植技術(shù)研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)3種不同的益智種質(zhì)資源除外形相差較大外，其果重、產(chǎn)量和化學(xué)成分含量也存在顯著差異。益智中主要功效成分倍半萜、二苯基庚烷和黃酮[5-6]的含量在3個(gè)種質(zhì)資源之間也有較大差異。為了進(jìn)一步研究益智不同種質(zhì)資源之間的質(zhì)量差異，尋找優(yōu)勢(shì)種質(zhì)資源，本課題對(duì)3種益智種質(zhì)資源的形態(tài)學(xué)和化學(xué)成分的差異進(jìn)行了研究，以期為益智的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源尋求提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地點(diǎn)

本研究共設(shè)4個(gè)調(diào)查地點(diǎn)，分別是：青松鄉(xiāng)打炳村、牙打村、南雅村和打賀村，采樣地點(diǎn)海拔高度為380～450 m的丘陵地帶，經(jīng)度位于109°14′～109°18′之間，緯度位于19°10′～19°40′之間，屬熱帶季風(fēng)氣候，年均降水量1725 mm，土壤類(lèi)型為山地黃壤，益智多間種于5～10年生的橡膠林下。

1.2 調(diào)查方法

結(jié)合益智種植栽培情況選擇5～7年生益智，咨詢當(dāng)?shù)氐乃庌r(nóng)確定調(diào)查點(diǎn)。由于益智間種于橡膠林下，在調(diào)查中，隨機(jī)選擇1行做為樣方，每個(gè)樣方包含6株益智，每個(gè)調(diào)查點(diǎn)選擇20～40個(gè)樣方進(jìn)行調(diào)查。通過(guò)咨詢藥農(nóng)確定益智生長(zhǎng)年限，測(cè)量益智株高、葉片形態(tài)等。

1.3 樣品采集

分析用益智樣品分別采集于青松鄉(xiāng)不同自然村的益智種植基地，均為五年生長(zhǎng)期益智，每個(gè)栽培的種質(zhì)資源分別采集植物樣品和果實(shí)樣品各6份，所有樣品經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院李友賓研究員鑒定，其基源為姜科山姜屬益智AlpiniaoxyphyllaMiq.。

1.4 形態(tài)比較

分別選取3個(gè)不同種質(zhì)資源的益智葉片各10批，用直尺測(cè)量葉片的長(zhǎng)度、寬度并計(jì)算長(zhǎng)寬比。選取3個(gè)不同種質(zhì)資源的益智種子各10批，每批20粒，干燥后稱重，計(jì)算粒重。

1.5 次生代謝產(chǎn)物分析

1.5.1 材料與試劑 益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素均為自制，采用HPLC峰面積歸一化法計(jì)算，純度均大于98%；圓柚酮購(gòu)于西亞化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)M5614。甲醇為色譜純，購(gòu)于天地公司。其它試劑為分析純。

島津LC-20AD超快液相色譜洗脫：二元泵，在線真空脫氣系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱。配ABI-4000plus串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測(cè)儀。

1.5.2 色譜方法 Waters Xbrige BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相為A(甲醇含0.1%甲酸)-B(水含0.1%甲酸)梯度洗脫：0～10 min，10%B～100%B；流速0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜檢測(cè)條件參照文獻(xiàn)[7]方法，具體參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 化合物的質(zhì)譜檢測(cè)條件

1.5.3 對(duì)照品溶液配制 取圓柚酮、益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素和白楊素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.5.4 供試品溶液的制備 參照文獻(xiàn)[7]方法，精密稱定干燥至恒重的樣品粉末(過(guò)4號(hào)篩) 0.5 g，每個(gè)樣品平行做3份，置具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，稱定重量，回流提取30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取適量用0.45 μm濾膜過(guò)濾，即得。

1.5.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取圓柚酮、益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素和白楊素對(duì)照品溶液，加甲醇制成5.0～1000 ng·mL-1的對(duì)照品混合溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行測(cè)定。分別以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得5個(gè)次生代謝產(chǎn)物的線性回歸方程，見(jiàn)表2。

表2 五個(gè)次生代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品工作液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，5個(gè)次生代謝產(chǎn)物峰面積的RSD在0.52%和1.53%之間。

1.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取益智圓果粉末(樣品2) 6份，按“2.5.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.5.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，RSD分別在2.6%和3.7%之間。

1.5.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取益智圓果粉末(樣品2) 6份，按“2.5.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h按“2.5.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，5種次生代謝產(chǎn)物的含量平均值分別為2.24、0.72、0.073、0.025、0.013 mg·g-1。RSD分別在1.2%和4.3%。

1.5.9 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量(圓柚酮、益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素素) 的益智圓果粉末6 份，每份約0.25 g，分別精密加入圓柚酮、益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素的對(duì)照品0.56、0.18、0.018、0.005 8、0.003 2 mg，按照“2.5.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果上述5個(gè)分析物的平均回收率分別為：102.6%、101.5%、98.9%、96.4%、94.2%；RSD 分別為1.3%、2.1%、0.89%、2.6%、1.6%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 不同種質(zhì)資源益智葉的形態(tài)學(xué)比較

用直尺測(cè)量益智葉片的長(zhǎng)度和寬度并計(jì)算長(zhǎng)寬比，觀察統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。根據(jù)表3可知，不同種質(zhì)資源益智葉的長(zhǎng)度在26.5～36.5 cm，寬度3.0～ 6.5 cm之間。三種益智種質(zhì)資源的葉長(zhǎng)相差較小，其中圓果益智的長(zhǎng)度在33～36cm之間，橢圓果益智的葉長(zhǎng)在30～34 cm之間，小果益智的葉長(zhǎng)在26～30 cm之間。三種益智栽培品種的葉寬有較大差異(P<0.05)，其中圓果益智的寬度在6.0～6.5 cm之間，橢圓果益智的寬度在4.0～4.5 cm之間，小果益智的葉寬在3.0～3.5 cm之間。

表3 不同益智栽培品種的葉片形態(tài)比較

注：#與圓果益智比較P<0.01，*與橢圓過(guò)益智比較P<0.05。

注：A.圓果益智、B.橢圓果益智、C.小果益智圖2 不同種質(zhì)資源益智的葉片典型形態(tài)圖

2.2 不同種質(zhì)資源益智果實(shí)的形態(tài)比較

用游標(biāo)卡尺測(cè)量益智果實(shí)的粒徑和長(zhǎng)度并計(jì)算長(zhǎng)徑比，用分析天平稱量益智的粒重，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。由表4可以看出，不同益智種質(zhì)資源果實(shí)的粒徑、長(zhǎng)度和粒重有較大差異(P<0.05)。其中圓果益智的粒徑在8.2～11.0 mm之間、長(zhǎng)度在15.1～22.0 mm之間，且粒重也最大；橢圓果益智的粒徑在6.9～8.2 mm之間，長(zhǎng)度在15.8～18.2 mm之間，粒重居于其它兩種益智果重之間；小果益智的粒徑最小，僅為4.0～7.1 mm，長(zhǎng)度在8.1～17.1 mm之間，粒重也最小。

表4 不同益智種質(zhì)資源的果實(shí)形態(tài)比較

注：#與圓果益智比較P<0.01，*與橢圓過(guò)益智比較P<0.05。

注：A.圓果益智；B.橢圓果益智；C.小果益智圖3 不同種質(zhì)資源益智果實(shí)形態(tài)圖

2.3 不同益智種質(zhì)資源中次生代謝產(chǎn)物的含量測(cè)定

取3種不同種質(zhì)資源的益智藥材粉末，按“2.5.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.2”項(xiàng)條件下，進(jìn)樣分析，測(cè)定各分析物的峰面積。以外標(biāo)法計(jì)算5個(gè)分析物在藥材中的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可以看出，3種益智種質(zhì)資源的次生代謝產(chǎn)物含量差異較大，其中圓果益智中圓柚酮含量最高，小果益智中益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素含量較高，橢圓果益智中白楊素含量較高。

表5 不同益智種質(zhì)資源的次生代謝產(chǎn)物含量

3 討論

益智為多年生草本植物，在白沙縣青松鄉(xiāng)主要采取公司+基地+農(nóng)戶的推廣種植方式，作者在青松鄉(xiāng)的走訪調(diào)查中發(fā)現(xiàn)益智的種質(zhì)資源對(duì)益智的品質(zhì)影響起主要作用，因此優(yōu)選益智優(yōu)質(zhì)種源是保證藥材品質(zhì)的重要因素。通過(guò)本項(xiàng)研究，作者向白沙縣農(nóng)業(yè)部門(mén)建議重點(diǎn)推廣種植圓果益智，酌情推廣橢圓果益智，逐步淘汰小果益智。

在對(duì)3種益智栽培種質(zhì)資源的研究過(guò)程中，本人參照文獻(xiàn)方法[8-10]對(duì)3個(gè)種質(zhì)資源的ITS2序列進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，不同種質(zhì)資源雖然外觀形態(tài)差異較大，但3者的ITS2基因序列完全相同，提示該3個(gè)種質(zhì)資源間的基因差異較小。

根據(jù)作者的前期研究結(jié)果[11]，圓柚酮主要分布于益智果實(shí)的種仁中，二苯基庚烷和黃酮主要分布于益智種皮中的差異性分布規(guī)律，同時(shí)結(jié)合益智去殼使用的傳統(tǒng)用法，益智種仁中的主要成分圓柚酮應(yīng)為益智質(zhì)量評(píng)價(jià)主要參考指標(biāo)。圓果益智中的圓柚酮含量最高，基本可以確定為質(zhì)量最優(yōu)品種，進(jìn)行大面積推廣。

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InvestigationandAnalysisofDifferentApliniaoxyphyllaCultivarsinQingsongofBaishaCounty

LI Yonghui1，2，WANG Yong2，TIAN Jianping2，GAO Bingmiao2，ZHANG Junqing1*

(1.HainanProvincialKeyLaboratoryofR&DonTropicPlants，Haikou571199，China；2.SchoolofPharmacy，HainanMedicalUniversity，Haikou571199，China)

Objective：To compare the morphological difference of threeApliniaoxyphyllaMiq.cultivars，analyze the contents of secondary metabolites in three cultivars and then find the best cultivars.Methodsthe length and width of leaf and fruit were measured，the fruit mass was weighed，and the contents of secondary metabolites was determined by LC-MSMS.ResultsThe length and width of leaf and fruit，fruit mass and secondary metabolite were significantly different among three cultivars.ConclusionThe quality of round fruitA.oxyphyllawas better than that of the other two cultivars.

AlpiniaoxyphyllaMiq.；cultivars；morphology；secondary metabolites

國(guó)家自然科學(xué)基金(81560738)，海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(xiàng)(ZDXM2014071)

*

張俊清，教授，研究方向：中藥新產(chǎn)品研究；Tel:(0898)66893460，E-mail：hy_jqzhang@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.017

2016-12-20)