杜彥，李潔亮，杜靜，盧惠燕，林秀峰

(中山市博愛醫(yī)院生殖中心，中山 528403)

反復(fù)種植失敗患者凍融胚胎移植的三種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的分析

杜彥，李潔亮，杜靜，盧惠燕，林秀峰*

(中山市博愛醫(yī)院生殖中心，中山 528403)

目的 使用GnRH-a 3.75 mg降調(diào)節(jié)激素替代、單純激素替代及自然周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對提高反復(fù)種植失敗患者凍融胚胎移植(FET)妊娠率的利弊分析。 方法 選取160例(周期)行FET的反復(fù)種植失敗患者，根據(jù)內(nèi)膜準(zhǔn)備方式分為自然周期組(A組)82例、激素替代周期組(B組)36 例和降調(diào)節(jié)激素替代組(C組)42例。比較三組患者的種植率、妊娠率、流產(chǎn)率和生殖激素水平。 結(jié)果 A、B和C三組患者的種植率分別為23.61%、21.25%和38.78%，臨床妊娠率分別為42.68%、36.10%和61.90%；C組與A組、B組的種植率和臨床妊娠率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A組與B組間胚胎移植日內(nèi)膜厚度差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(10.40±1.81)mm vs.(9.12±1.61)mm](P<0.05)。三組患者的流產(chǎn)率和異位妊娠率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 與自然周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及傳統(tǒng)激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備方案比較，3.75 mg GnRH-a降調(diào)節(jié)激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備方式可提高反復(fù)種植失敗患者凍融胚胎移植妊娠率而不增加流產(chǎn)率。

反復(fù)種植失?。?垂體降調(diào)節(jié)； 凍融胚胎移植； 子宮內(nèi)膜容受性

(JReprodMed2017，26(11)：1104-1108)

1983年世界上第一例冷凍胚胎移植獲得臨床妊娠[1]，1985年第一例凍融胚胎獲得健康嬰兒出生[2]。經(jīng)過30多年的努力，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及其衍生技術(shù)已取得了巨大的進步。盡管如此，仍有少部分夫婦助孕治療后未能獲得妊娠。胚胎著床是一個復(fù)雜的過程，有種植潛能的胚胎和具有容受性的子宮內(nèi)膜是胚胎種植的必要因素?；颊呤┬信咛ヒ浦埠?，未能妊娠的最主要原因是種植失敗。對于胚胎移植后未獲妊娠的患者，本中心以<40歲連續(xù)2個周期共移植4個及以上優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或2個及以上優(yōu)質(zhì)囊胚未獲妊娠稱為反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)。

RIF可能是由于胚胎發(fā)育異常、子宮內(nèi)膜容受性差，或者多種因素影響的最終結(jié)果。夫婦間遺傳學(xué)的異常、精子缺陷、胚胎非整倍體及透明帶異常等是RIF中的胚胎因素。病理狀態(tài)的子宮內(nèi)膜如宮腔粘連、子宮內(nèi)膜增生癥、粘附分子及免疫因子表達的異常等都可能降低子宮內(nèi)膜容受性。而肥胖、吸煙、甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥、子宮內(nèi)膜異位癥和輸卵管積水則可能對兩方面都不利。

資料與方法

一、研究對象與分組

回顧分析2016年1～10月在我中心診斷為RIF患者進行凍融胚胎移植(FET)的160個周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)<40歲連續(xù)2個周期移植4個及以上優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或2個及以上優(yōu)質(zhì)囊胚種植失??；(2)所有患者月經(jīng)周期規(guī)律且經(jīng)超聲或?qū)m腔鏡證實宮腔形態(tài)正常，無子宮肌瘤、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜增生過長、子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病；(3)本次移植至少有1枚優(yōu)質(zhì)胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮內(nèi)膜過薄(<7 mm)；(2)BMI≥26 kg/m2；(3)染色體異常；(4)內(nèi)科合并癥如甲狀腺功能異常。

根據(jù)內(nèi)膜準(zhǔn)備方式分為自然周期組(A組)82例、激素替代周期組(B組)36 例和降調(diào)節(jié)激素替代組(C組)42例。比較三組患者的種植率、妊娠率、流產(chǎn)率和生殖激素水平。

二、研究方法

1.內(nèi)膜準(zhǔn)備：(1)自然周期組(A組)：月經(jīng)周期第3～5天B超檢查排除卵巢囊腫，依據(jù)患者月經(jīng)周期長短，月經(jīng)第9～11天再次B超監(jiān)測卵泡大小，當(dāng)卵泡直徑≥14 mm，內(nèi)膜厚度≥6 mm時，持續(xù)監(jiān)測尿或者血LH值，必要時肌肉注射HCG10 000 U誘導(dǎo)排卵。排卵后第3天FET卵裂期胚胎，第5天移植囊胚。排卵后給予地屈孕酮(達芙通，雅培，荷蘭)20 mg，bid，肌肉注射HCG 2 000 U，q3 d×3次行黃體支持；(2)激素替代周期組(B組)：月經(jīng)的第3～4天B超監(jiān)測內(nèi)膜情況，如內(nèi)膜厚度>5 mm則不入組參與最后的實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計。當(dāng)日給予補佳樂(含戊酸雌二醇1 mg，拜耳，德國)2片，bid，連續(xù)服藥7 d，第8天監(jiān)測內(nèi)膜厚度，如厚度>6 mm則繼續(xù)原用藥劑量，如厚度<6 mm，加藥至每次3片，bid連續(xù)服藥5 d。第12天時再次監(jiān)測內(nèi)膜，厚度<8 mm則加藥至每次4片，bid，總服藥周期最長不超過3周，3周后如內(nèi)膜厚度仍<8 mm，則取消周期。當(dāng)服藥天數(shù)≥12 d，內(nèi)膜厚度≥8 mm時，監(jiān)測血清雌二醇(E2)水平，當(dāng)E2>700 pmol/L時，繼續(xù)服用補佳樂并加黃體酮60 mg/d肌肉注射。排卵后第4天FET卵裂期胚胎，第6天移植囊胚。移植術(shù)后繼續(xù)補佳樂與黃體酮行黃體支持；(3)降調(diào)節(jié)激素替代組(C組)：月經(jīng)第1～3天排除妊娠后予GnRH-a(達菲林注射液，3.75 mg/支，博福-益普生，法國)3.75 mg肌肉注射，28 d后抽血及B超檢查，達到垂體降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)即E2<183.5 pmol/L、卵泡刺激素(FSH)<5 U/L、黃體生成激素(LH)<5 U/L、子宮內(nèi)膜厚度<5 mm時，采用HRT方案準(zhǔn)備內(nèi)膜(方法同B 組)，但黃體支持增加地屈孕酮(達芙通，雅培，荷蘭)20 mg，bid。

2.胚胎凍融和移植：胚胎凍融和移植按玻璃化冷凍操作常規(guī)解凍、復(fù)蘇。卵裂期胚胎分四級。Ⅰ級胚胎：卵裂球大小均勻，無細胞死亡，碎片<5%；Ⅱ級胚胎：卵裂球大小較均勻，碎片占5%～20%；Ⅲ級胚胎：碎片較多，占21%～50%的胚胎；Ⅳ級胚胎：卵裂球不等大，碎片>50%，胞質(zhì)顆粒不均，變黑，或有大量空泡。解凍后卵裂球成活率≥50%，認為該胚胎復(fù)蘇。囊胚的質(zhì)量通過鏡下形態(tài)學(xué)觀察進行評定，根據(jù)內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞進行質(zhì)量評估。內(nèi)細胞團分級：A 級，細胞數(shù)目多，排列緊密；B 級，細胞數(shù)目少，排列松散；C 級，細胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細胞分級：A 級，上皮細胞層由較多的細胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B 級，上皮細胞由不多的細胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C級，上皮細胞層由稀疏的細胞組成。本中心優(yōu)胚標(biāo)準(zhǔn)：卵裂期7～9細胞Ⅰ級和Ⅱ級胚胎，囊胚評分為3AB及以上胚胎。患者均按衛(wèi)生部的規(guī)定移植1～3 個復(fù)蘇胚胎。

3.觀察指標(biāo)及妊娠結(jié)局判斷：移植后繼續(xù)用藥至第12～14天測血HCG≥25 U/L且持續(xù)升高，2周后B超監(jiān)測孕囊，確定是否臨床妊娠；臨床妊娠確認后持續(xù)黃體支持至孕8～12周。早期流產(chǎn)率為移植后3個月內(nèi)流產(chǎn)人數(shù)與臨床妊娠人數(shù)的比值；胚胎種植率=種植胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)× 100%。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

共納入患者160例，其中A組82例，B組36例，C組42例?；颊吣挲g、體重指數(shù)(BMI)、卵巢基礎(chǔ)狀態(tài)、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)等一般情況均符合正態(tài)分布，經(jīng)檢驗組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。移植日子宮內(nèi)膜厚度自然周期與激素替代周期有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

二、胚胎移植后臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、胚胎種植率及異位妊娠率比較

三組間異位妊娠率、早期流產(chǎn)率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，自然周期組與激素替代周期組患者的臨床妊娠率、胚胎種植率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；但是降調(diào)節(jié)激素替代組的臨床妊娠率、胚胎種植率與自然周期組、激素替代周期組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表2)。

表1 各組患者一般情況及各項觀察指標(biāo)的比較

注：與B組比較，*P<0.05

表2 三組患者移植后臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、胚胎種植率及異位妊娠率(%)

注：與A組及B組比較，*P<0.05

討 論

FET的成功妊娠明顯增加了IVF-ET的累積妊娠率。在國家全面二孩政策出臺后，F(xiàn)ET為許多有冷凍胚胎的高齡患者提供了妊娠的希望。在胚胎予以冷凍保存的情況下，子宮內(nèi)膜條件的好壞直接關(guān)系FET技術(shù)的成功與否。目前，F(xiàn)ET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案主要有自然周期、激素替代、降調(diào)節(jié)激素替代、促排卵周期等。臨床上可依據(jù)患者的原發(fā)疾病、依從性、經(jīng)濟能力等選擇不同的方案。

自然周期是FET中最為常見的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案，符合胚胎著床的生理要求，且實施方便、花費少。是月經(jīng)周期規(guī)律且有正常排卵患者最經(jīng)濟有效的方案。正常生理過程中，受精卵著床經(jīng)過定位、黏附和侵入三個過程，但子宮僅有一個極短的窗口期允許受精卵著床，稱為種植窗，多為LH峰后7～11 d，非常短暫[3]。因此監(jiān)測過程中需要反復(fù)觀察患者尿液或血液的LH數(shù)值及卵泡發(fā)育情況以確定準(zhǔn)確的排卵及種植窗開啟時間，其過程繁瑣，尤其是患者出現(xiàn)卵泡不破裂黃素化時更難監(jiān)控，周期取消率高。另有少部分患者可能出現(xiàn)空卵泡，只有形態(tài)學(xué)改變，沒有雌激素、孕激素的周期變化，妊娠率也會下降。在本研究中對于RIF患者，自然周期組的妊娠率較激素替代組高，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，不建議做為常規(guī)選擇方案。

激素替代周期多用于排卵障礙或者子宮內(nèi)膜薄的患者。激素替代周期中患者復(fù)診的次數(shù)明顯減少，而且可依據(jù)患者的工作安排適當(dāng)調(diào)整就診及手術(shù)時間，同時避免因排卵異常導(dǎo)致的取消周期。但是單純在早卵泡期添加外源性雌激素?zé)o法保證垂體被完全抑制，雌激素的增加可能負反饋誘發(fā)內(nèi)源性早發(fā)LH 峰，從而影響子宮內(nèi)膜微環(huán)境狀態(tài)，降低子宮內(nèi)膜容受性[4]。其次，激素替代周期依靠外源的雌、孕激素維持妊娠，較自然周期黃體支持用藥劑量大、時間長，患者的經(jīng)濟負擔(dān)會有所增加。雖然在本研究中患者的流產(chǎn)率較低，但統(tǒng)計學(xué)無差異，不建議作為RIF的首選方案。

降調(diào)節(jié)激素替代是在FET前給予GnRH-a降調(diào)節(jié)預(yù)處理后再使用激素替代周期行內(nèi)膜準(zhǔn)備。GnRH廣泛分布于神經(jīng)、內(nèi)分泌、生殖、消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，通過傳遞信息，使各系統(tǒng)達到協(xié)調(diào)統(tǒng)一。當(dāng)GnRH-a與腦垂體上的GnRH受體結(jié)合初期會促進其分泌FSH和LH，引起用藥初期的激發(fā)作用，而在用藥5～7 d后FSH和LH開始下降，14 d內(nèi)降低到基礎(chǔ)值以下，體內(nèi)的雌激素處于早卵泡期甚至達絕經(jīng)期水平，卵巢呈現(xiàn)靜止?fàn)顟B(tài)，可抑制早發(fā)LH峰的出現(xiàn)，獲得更高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率[5]；Huang 等[6]的研究表明，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞及上皮細胞均存在GnRH受體，體外細胞培養(yǎng)實驗中，它能夠激活絨毛膜滋養(yǎng)層和底蛻膜細胞上的尿激酶型纖維蛋白溶解酶，調(diào)控子宮內(nèi)膜間質(zhì)蛋白水解，從而有利于內(nèi)膜蛻膜化和早期囊胚著床[7]。Taskin等[8]的研究提示GnRH-a降調(diào)節(jié)后行激素替代周期中，在予孕激素替代第5天行子宮內(nèi)膜活檢發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜胞飲突成熟發(fā)育數(shù)目較非GnRH-a激素替代周期組顯著增多且治療反應(yīng)性增強，妊娠率提高。洪宇等[9]研究表明GnRH-a可以增加子宮內(nèi)膜整合素avβ3 的表達，整合素avβ3 可以通過介導(dǎo)滋養(yǎng)層細胞與子宮內(nèi)膜上皮細胞之間的相互作用，參與囊胚黏附，使胚胎植入子宮內(nèi)膜，從而提高子宮內(nèi)膜容受性。故GnRH-a不僅可使卵泡發(fā)育同步化，而且可增加子宮內(nèi)膜容受性。因此，降調(diào)節(jié)激素替代可減少自發(fā)卵泡發(fā)育，降低取消率，使子宮內(nèi)膜更易接受外源性激素調(diào)控，改善胚胎種植環(huán)境，還可靈活安排胚胎移植時間。

RIF的發(fā)生機制尚未明確，有不少的研究認為與免疫因素有關(guān)。對于存在免疫異常的患者，在FET中使用GnRH-a降調(diào)節(jié)，可部分逆轉(zhuǎn)Th2類細胞因子，從而使Th1/Th2比例達到平衡，由此促進母胎免疫耐受，避免種植失敗及妊娠丟失。Yang等[10]、方穎等[11]、吳曉燕等[12]研究表明，對于RIF患者，使用降調(diào)節(jié)激素替代周期較其他內(nèi)膜準(zhǔn)備方案顯著提高胚胎種植率、臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率。

本研究通過回顧性分析也得出相同的結(jié)論：對于RIF患者FET時使用降調(diào)節(jié)激素替代周期的胚胎種植率和臨床妊娠率高于激素替代周期與自然周期。

但是，由于長效GnRH-a的價格較高，使用此方案延長了患者FET的準(zhǔn)備時間，增大了藥物的使用，增加了患者的經(jīng)濟負擔(dān)。因此，我們在臨床上并不將其作為首選的FET方案。但對于RIF的患者可最終提高 FET 的妊娠率，可作為首選。

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[編輯：谷炤]

Analysis of the outcome of three kinds of endometrial preparation protocols in frozen-thawed embryo transfer cycle in patients with repeated implantation failure

DUYan，LIJie-liang，DUJing，LUHui-yan，LINXiu-feng*

ReproductiveCenterofBoAiHospital，Zhongshan528403

Objective：To analyze the outcome of down-regulation & hormone replacement，hormone replacement only and natural cycle in frozen-thawed embryo transfer in patients with repeated implantation failure.

Methods：A total of 160 patients with repeated implantation failure were selected and divided into natural cycle(group A，n=82)，hormone replacement cycle(group B，n=36) and down-regulation & hormone replacement cycle(group C，n=42).The implantation rate，pregnancy rate，abortion rate and reproductive hormone level were compared among the three groups.

Results：The implantation rate was 23.61%，21.25% and 38.78% and the pregnancy rate was 42.68%，36.10% and 61.90% in group A，B，C respectively.There were significant differences in implantation rate and pregnancy rate between Group C and the other two groups(P<0.05).There was significant difference in endometrial thickness[(10.40±1.81) mm vs.(9.12±1.61) mm]on day of transplantation between Group A and Group B(P<0.05).There were no significant differences in abortion rate and ectopic pregnancy rate among the three groups(P>0.05).

Conclusions：Compared with hormone replacement only cycle and natural cycle，pregnancy rate can be effectively improved by hormone replacement cycle after down regulation in the patients with repeated implantation failure，and it does not increase the abortion rate.

Repeated implantation failure； Down regulation； Frozen-thawed embryo transfer； Endometrial receptivity

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.11.011

2017-08-29；

2017-09-12

杜彥，女，廣東中山人，副主任醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

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