楊 信， 李布勇， 范小平， 李慶霞， 楊綺紋

（海南省動物疫病預(yù)防控制中心，海南海口 570203）

飼料中隱蔽嘔吐毒素研究進(jìn)展

楊 信， 李布勇*， 范小平， 李慶霞， 楊綺紋

（海南省動物疫病預(yù)防控制中心，海南?？?570203）

嘔吐毒素是鐮刀菌屬毒素中的一種，在飼料原料中通常會被衍生為乙?；吞腔螒B(tài)，統(tǒng)稱為隱蔽嘔吐毒素。本文主要對飼料中隱蔽嘔吐毒素的形成機(jī)制、檢測方法、污染分布情況、毒性機(jī)理、以及體外和體內(nèi)的毒性進(jìn)行了綜述。

隱蔽嘔吐毒素；檢測方法；污染分布；體外毒性；體內(nèi)毒性

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，又稱嘔吐毒素（DON），是一種主要由鐮刀菌屬產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，屬于B類單端孢霉烯毒素，其對谷物的污染程度位于鐮刀菌毒素之首，對動物健康威脅巨大，尤其對豬的危害最大，其中毒癥包括拒食、嘔吐、免疫抑制和繁殖障礙等（陳繼發(fā)，2016）。DON多分布于玉米、小麥、大麥等谷物中，在玉米加工副產(chǎn)物DDGS、玉米蛋白飼料中含量呈累積增加的趨勢。目前我國農(nóng)業(yè)部公告中對飼料中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為1000 μg/kg，但是對飼料原料玉米、小麥及副產(chǎn)物中尚沒有限量標(biāo)準(zhǔn)。

飼料中嘔吐毒素通常和其衍生化形態(tài)共同存在，也被稱為隱蔽嘔吐毒素。衍生化形態(tài)包括乙酰化形式3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3ADON），15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15ADON）和糖基化形式脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON3G），不同修飾形態(tài)的嘔吐毒素具有相同的基本分子式，但是其特征功能團(tuán)不同（He，2010）。

近年來大量試驗發(fā)現(xiàn)飼料中隱蔽嘔吐毒素對動物的毒性不容忽視。本文就隱蔽嘔吐毒素的形成機(jī)制、檢測方法、污染分布情況、毒性機(jī)理，以及體外和體內(nèi)的毒性研究進(jìn)行了綜述。

1 隱蔽嘔吐毒素形成機(jī)制

植物被無法降解的霉菌毒素感染后，會啟動自身防御機(jī)制來降低霉菌毒素對其的傷害，機(jī)制分為三個階段：第一階段激活，毒素被水解和氧化，將親脂性的部分轉(zhuǎn)為親水性，為第二階段做準(zhǔn)備；第二階段修飾，毒素被內(nèi)源性的谷胱甘肽、糖、氨基酸、硫酸鹽、乙?；揎?，進(jìn)一步加強極性和親水性；第三階段隔離，被修飾的霉菌毒素經(jīng)過ATP-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移作用轉(zhuǎn)移到液泡、非原質(zhì)體（細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙）中來降低霉菌毒素對植物的傷害（Coleman，1997）。嘔吐毒素由于其親水性，其在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化直接從第二階段開始，主要形成乙酰化的3ADON、15ADON和葡糖苷化的DON3G。經(jīng)過修飾的嘔吐毒素會一直存在于植物原料內(nèi)，并會隨著食用、消化和吸收而產(chǎn)生毒性來損害家畜。

2 隱蔽嘔吐毒素的檢測方法

目前對隱蔽嘔吐毒素的檢測方法主要是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（表1），提取液一般為乙腈/水（84/16），Zbynek和 Dzumand 等（2014）用 0.1%甲酸水/乙腈（50∶50）提取液也達(dá)到了很好的提取效果；提取方式一般采用超聲或振蕩處理，但時間一般不低于30 min。3ADON、15ADON和DON3G在基質(zhì)玉米、小麥、配合飼料中均呈基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此需選擇合適的凈化體系降低雜質(zhì)對檢測準(zhǔn)確性的影響，國內(nèi)凈化主要采取SPE萃取小柱（Mycospin 400多功能凈化柱），國外采取直接提取不凈化或采用QuEChERS凈化體系，包括采用硫酸鎂、正己烷、C18吸附的凈化劑，但是各種凈化體系并不能很好的減少基質(zhì)效應(yīng)對測量的影響，因此建議采取不同基質(zhì)匹配校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液來定量，從而獲得更好的回收率。Zbynek（2014）證明，C18吸附劑雖然不能消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，但是能明顯吸附飼料中的脂內(nèi)物質(zhì)來降低對色譜柱的影響，因此在檢測中建議加入凈化步驟而不是直接提取稀釋后上機(jī)檢測。

表1 隱蔽嘔吐毒素的不同檢測方法

3 隱蔽嘔吐毒素在飼料原料和飼料成品中的污染情況

隨著液質(zhì)技術(shù)的發(fā)展，目前關(guān)于隱蔽嘔吐毒素在飼料原料和飼料成品中的污染狀況研究報道較多（表2）。研究表明ADON+15ADON在681份小麥樣品中檢出最大值為14604.2 μg/kg，平均值為 7983.5 μg/kg， 檢出率為63.2%，DON3G在 30份小麥中檢出最大值為730 μg/kg，平均值為174 μg/kg，檢出率為 83.3%，Zachariasova等（2014）在豬配合飼料中對3ADON、15ADON和DON3G均有不同程度的檢出，隨著對隱蔽嘔吐毒素在飼料原料、成品污染的現(xiàn)狀和其毒性的進(jìn)一步認(rèn)識，建議對我國飼料原料和成品中隱蔽嘔吐毒素的污染情況和其合理的限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。

表2 飼料原料和成品中隱蔽嘔吐毒素的含量

4 嘔吐毒素的毒性機(jī)理

目前乙?；吞腔瘒I吐毒素的關(guān)注點主要在于是否被體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)化為原型產(chǎn)生毒性，以及本身是否有毒性。因此關(guān)注嘔吐毒素原型毒性的主要產(chǎn)生機(jī)理，有利于對隱蔽嘔吐毒素的毒性進(jìn)行評價。

4.1 嘔吐毒素的核糖體應(yīng)激反應(yīng) 研究證明，DON能同核糖體的60S亞基結(jié)合。DON的3-羥基基團(tuán)能同核糖體60S亞基A-面上的鎂原子和核苷酸結(jié)合（Pierron，2016），同時 Pierron（2016）還發(fā)現(xiàn)，DON的第3位、12位、15位分別能同核糖體上肽基轉(zhuǎn)移酶中心上的核糖體形成氫鍵。DON與核糖體結(jié)合后，首先激活蛋白激酶（PKR）、斯裂原活化蛋白激酶（MAPKs），進(jìn)而激活雙鏈上游關(guān)鍵傳感器（RNAPKR）。激活PKR后會觸發(fā)以下機(jī)制：（1）通過激活腫瘤抑制基因（P53)、氨基末端激酶（JNK）、P38 蛋白、核因子 kB （NF-kB)而對細(xì)胞分化和凋亡產(chǎn)生影響；（2）使真核啟動子2α磷酸化而抑制蛋白翻譯，從而影響蛋白質(zhì)的合成來產(chǎn)生介毒性；（3）通過激活信號傳導(dǎo)因子、轉(zhuǎn)錄激活子、干擾素調(diào)節(jié)因子來影響基因表達(dá)，進(jìn)而通過調(diào)控細(xì)胞生長、變異、凋亡而引起機(jī)體各種生理反應(yīng)。

4.2 氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和DNA損傷反應(yīng)嘔吐毒素能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和 DNA 損傷（Mishara，2014）。 Krishnaswamy等（2010)報道，人結(jié)腸細(xì)胞經(jīng)DON感染24h后，活性氧含量大量增加，谷胱甘肽過氧化物酶、抗氧化酶、過氧化物歧化酶的活性降低，同時誘發(fā)環(huán)氧酶的表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的磷酸化而引起細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

5 乙?；瘒I吐毒素的毒性

5.1 乙?；瘒I吐毒素（3ADON、15ADON）的體外毒性 目前體外研究報道均證實，乙酰化嘔吐毒素能同嘔吐毒素一樣直接產(chǎn)生毒性作用，毒性從強到弱依次為DON≈15ADON＞3ADON。Nathn Broekaert等（2016）證實，乙酰化嘔吐毒素能影響動物腸道上皮細(xì)胞的增殖和發(fā)育，其采用流式細(xì)胞術(shù)研究原型嘔吐毒素和乙?；瘒I吐毒素對體外小腸上皮細(xì)胞的毒性發(fā)現(xiàn)，其對小腸上皮細(xì)胞的毒性為：DON≈15ADON＞3ADON。Pinton 等（2014)報道，同對照相比，DON、3ADON和15 ADON分別能使豬腸道上皮細(xì)胞（IPEC-1）增殖指數(shù)在24 h內(nèi)降低 60%（P＜ 0.001），13%（P＜ 0.05） 和 69%（P＜0.001）， 其中10 μM的15 ADON能使緊密連接蛋白的表達(dá)降低40%。試驗還發(fā)現(xiàn)DON、3ADON和15ADON均能激活I(lǐng)PEC-1上MAPKS的活性，繼而產(chǎn)生炎性反應(yīng)。

3ADON和15ADON還能影響細(xì)胞的生長。Alassane-Kpembi（2015)等采用 MTT比色法研究DON、3ADON和15ADON對人克隆結(jié)腸腺細(xì)胞（Caco-2）生長的影響，結(jié)果表明，DON和15ADON 的 80%抑制濃度（EC80）為 16.5 μmol/L和10.5 μmol/L，3ADON也能抑制Caco-2的活性，但是其毒性要低于DON和15ADON，其EC80為125 μmol/L。 而 Ana Juan-García（2015）發(fā)現(xiàn)，對于Hep G2細(xì)胞生長，3ADON毒性要大于15ADON，其采用MTT比色法研究對Hep G2細(xì)胞生長的影響 發(fā) 現(xiàn) ，3ADON 的 IC50 為 3.6 ～ 6.2 μmol/L，15ADON的 IC50為5.2～8.1 μmol/L。

5.2 乙?；瘒I吐毒素（3ADON、15ADON）的體內(nèi)毒性 通過體內(nèi)飼養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，3ADON和15ADON分別被肉雞和豬采食后均能被吸收和分解成DON原型而產(chǎn)生毒性，但是肉雞對3ADON和15ADON的耐受性要大于豬。Nathan Broekaert等（2015）報道，DON、3ADON 和 15ADON 被肉雞采食后，吸收率分別為10.6%、18.2%和42.2%。3ADON被吸收后全部分解為 DON，75.4%的15ADON被吸收后分解為DON，故3ADON和15ADON在被家禽吸收后會分別轉(zhuǎn)化為18.2%和31.9%的DON而對機(jī)體產(chǎn)生毒性。同時由于15ADON會產(chǎn)生更多的DON原型被吸收，故對于肉雞，15ADON的毒性被認(rèn)為還要大于DON。對于豬，DON、3ADON和15ADON被采食后完全被吸收，而且完全分解為DON產(chǎn)生毒性，故對于豬，3ADON和15ADON的體內(nèi)毒性不容忽視。

6 糖基化嘔吐毒素的毒性

6.1 糖基化嘔吐毒素（D3G）的體外毒性 由于D3G中的葡萄糖苷基團(tuán)形成的空間位置阻礙，D3G不能像DON一樣同核糖體60S亞基A-面上的肽基轉(zhuǎn)移酶中心結(jié)合，而直接產(chǎn)生毒性。體外試驗證明，DON3G的直接毒性要遠(yuǎn)低于DON，Alix Pierron等（2015）對人小腸Caco-2細(xì)胞進(jìn)行體外試驗發(fā)現(xiàn)，D3G不能激活JNK和蛋白激酶（MAPK）而產(chǎn)生毒性。 Pierron等（2015）研究 DON和DON3G對Caco-2細(xì)胞生長的影響，48 h后，DON 的半抑制濃度（IC50）為 1.3 μmol/L，與此對比，10 μmol/L的 DON3G對 Caco-2細(xì)胞生長不產(chǎn)生任何毒性。

6.2 糖基化嘔吐毒素（D3G）的體內(nèi)毒性 體外試驗證明D3G基本不產(chǎn)生毒性，對其毒性的評價主要集中在D3G被采食后是否能轉(zhuǎn)化為DON原型而對動物產(chǎn)生毒性。試驗證明D3G被采食后可形成DON原型。

Veronika（2014)等分別在第 1、5 天和 9 天對斷奶仔豬強飼對照日糧、D3G （116 μg/kg·BW）和DON（75 μg/kg·BW）的日糧，并在飼喂后 24 h 對尿液和糞便全收集，分析尿液和糞便中的DON、D3G和其他代謝產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糞便中基本回收不到DON及代謝產(chǎn)物，回收集中在尿液中，其中單獨飼喂含DON日糧斷奶仔豬尿中總回收84.9%，分別為51.4%DON，19.0%DON-3-GlcA和14.5%DON-15-GlcA，單獨飼喂含D3G日糧，尿液中出現(xiàn)了DON原型，總回收為40.3%，其中含 21.6%DON，3.4%DON-3-GlcA，6.8%DON-15-GlcA，5.9%DOM-1，2.6%D3G。 表明采食 D3G 的生物活性要低于DON，從回收看只占DON的一半左右。但是D3G在被吸收后可釋放出糖苷配基產(chǎn)生原型DON，并被吸收和參與體內(nèi)代謝而產(chǎn)生毒性。同時單獨飼喂含D3G豬尿液中的產(chǎn)物出現(xiàn)了單獨飼喂DON中并沒有產(chǎn)生的DOM-1，在豬的消化吸收途徑中，DOM-1主要是通過豬尾腸的微生物分解DON而產(chǎn)生，因此可以推測單獨飼喂DON時，DON基本都是在近端被小腸吸收，進(jìn)而代謝，而D3G則部分進(jìn)入尾腸，被分解為DON原型產(chǎn)生毒性，在尾腸中DON代謝途徑包括修飾為DON-3-GlcA和DON-15-GlcA，也可以分解為DOM-1被解毒。

Nathan Broekaert等（2017）通過體內(nèi)試驗測定血漿中的DON和其代謝物，D3G被肉雞采食后并不能降解為DON原型，但是DON被采食后，在血漿中可檢測到DON的硫酸鹽化產(chǎn)物DONS，D3G被豬采食后，血液中可檢測到DON原型和DON-GlcA產(chǎn)物，但是D3G被采食后的吸收程度（16.1±5.4）%要低于 DON（81.3±17.4）%。 因此，DON在豬體內(nèi)的第二階段修飾主要為葡糖苷酸化（Veronika等，2014），在雞體內(nèi)則主要是硫酸鹽化，同時DON代謝中第二階段的修飾作用在雞體內(nèi)更為廣泛，這也可能是雞比豬耐受DON毒性能力強的原因。

7 小結(jié)

綜上所述，隱蔽嘔吐毒素在飼料中的污染情況不容忽視，應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測其含量時一定要考慮基質(zhì)效應(yīng)，定量需要使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。隱蔽嘔吐毒素的體外毒性從強到弱依次為 DON≈15ADON＞3ADON＞＞D3G， 同時飼養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，乙?；?5ADON、3ADON和D3G均能在豬體內(nèi)轉(zhuǎn)化為DON原型而產(chǎn)生毒性。目前對于隱蔽嘔吐毒素的研究尚不多見，仍有一些問題有待進(jìn)一步解決，例如：隱蔽嘔吐毒素在動物體內(nèi)的消化、吸收和代謝過程還需要進(jìn)一步研究，同時研究飼料中不同濃度隱蔽嘔吐毒素對動物的毒性作用和生產(chǎn)性能的影響，從而為制定隱蔽嘔吐毒素在飼料中的科學(xué)限量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

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The deoxynivalenol （DON）is one of the toxins of fusarium，and often derived as acetylated and glucoside forms in feedstuff，which are collectively called hidden deoxynivalenol.In this paper，the formation mechanism，determination，distribution，toxicodynamics，cytotoxicity in vitro and vivo of hidden deoxynivalenol in feed were reviewed.

hidden deoxynivalenol；determination；distribution；cytotoxicity in vitro；cytotoxicity in vitro

S816.9

A

1004-3314（2017）21-0007-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172102

海南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全體系建設(shè)項目（UQ74051）

*通訊作者