王小姣， 杜全能， 陳思宇，朱文娟，胡 超， 蘭時(shí)樂*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵工藝研究

王小姣1， 杜全能1， 陳思宇2，朱文娟2，胡 超2， 蘭時(shí)樂2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

為提高嗜酸小球菌液體發(fā)酵的活菌數(shù)，本試驗(yàn)采用生料發(fā)酵技術(shù)和單因素試驗(yàn)法研究了發(fā)酵培養(yǎng)基組成以及發(fā)酵條件對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響，并采用正交試驗(yàn)法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和條件為葡萄糖2.5%、酵母抽提粉0.3%、蛋白胨 0.6%、K2HPO40.1%、CH3COONa 0.6%、NaCl 3%、發(fā)酵溫度40℃、種齡60 h、接種量20%。在上述優(yōu)化條件下發(fā)酵36 h，嗜酸小球菌的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為11.258 lg cfu/mL。研究結(jié)果顯示了液體生料發(fā)酵技術(shù)適合于飼用嗜酸小球菌的生產(chǎn)。

嗜酸小球菌；生料發(fā)酵；活菌數(shù)；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

嗜酸小球菌（Pediococcus acidilactici），又名乳酸片球菌，是一種無芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性乳酸菌，其分布范圍較廣，目前已從人的糞便（Mathys，2009； Millette，2008）、酸馬奶（郝彥玲，2009）、發(fā)酵香腸（Albano 和 Cosansu，2007）、羊的瘤胃（Cobos，2011）、 牛 糞 （Rodriguez-Palacios，2009） 等 樣品中分離得到，并對(duì)其產(chǎn)乳酸片球菌素進(jìn)行了大量的研究，且取得了一系列的研究成果。嗜酸小球菌作為動(dòng)物益生菌，其安全性和益生性已得到國(guó)際主要權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)證，是專業(yè)被選擇用來改善動(dòng)物消化道微生態(tài)系統(tǒng)的安全、環(huán)保飼料添加劑（余德光，2008）。關(guān)于嗜酸小球菌在動(dòng)物上的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)在日本鰻鱺（余德光，2008）、凡納濱對(duì)蝦（余德光，2006）、鱖（夏耘，2016）的生長(zhǎng)和免疫功能、體液免疫因子以及腸道微生物構(gòu)成等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，嗜酸小球菌能有效促進(jìn)水生生物的生長(zhǎng)，提高免疫力和抑制鱖仔稚魚腸道內(nèi)病原菌的繁殖，顯示了嗜酸小球菌在動(dòng)物養(yǎng)殖中良好的應(yīng)用前景。本研究以嗜酸小球菌為研究對(duì)象，通過生料發(fā)酵技術(shù)和單因素試驗(yàn)法研究嗜酸小球菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成以及發(fā)酵條件，并采用正交試驗(yàn)法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為嗜酸小球菌的規(guī)?；a(chǎn)及其在動(dòng)物飼養(yǎng)中的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 嗜酸小球菌，由健康的杜×長(zhǎng)×大三元雜交商品豬腸道中分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：大豆蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母抽提粉0.5%，乳糖2%，葡萄糖2%，碳酸鈣1%，pH 5.8~6.2。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏 1%，酵母提取粉 0.5%，葡萄糖 2%，Tween80 0.1%，K2HPO40.2%，無水乙酸鈉0.5%，檸檬酸二銨0.2%，MgSO4·7H2O 0.058%，MnSO4·H2O 0.025%，pH 6.2~6.6。

以上培養(yǎng)基均在112℃條件下滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%，酵母粉0.4%，無水乙酸鈉0.5%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.15%，NaC1 3%，pH自然。

1.1.3 主要儀器與藥品

1.1.3.1 主要儀器設(shè)備：電子天平（TMP-510，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；分析天平（AL204，梅特勒—托利多儀器有限公司）；細(xì)菌培養(yǎng)箱（MJ-160C，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；高壓滅 菌 鍋 （SS-325，TOMY.KOGYO.CO，LTD）； 單 人單面超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1B（U），蘇州設(shè)備凈化有限公司）。

1.1.3.2 主要藥品：牛肉膏、蛋白胨（BP，上海盛思生化科技有限公司）；酵母提取粉（BP，北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；檸檬酸二銨、葡萄糖、四水硫酸錳、七水硫酸鎂、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉、吐溫80、乳糖、氫氧化鈉 （AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；瓊脂（BP，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；大豆蛋白胨（BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；碳酸鈣（AR，上海泗聯(lián)化工廠有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)：將保存于4℃冰箱的嗜酸小球菌接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)3~5 d，備用。

液體種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)3~5 d的斜面菌種接種于裝有100 mL/250 mL三角瓶中的液體種子培養(yǎng)基中，于37℃下恒溫靜置培養(yǎng)36 h，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)成熟的液體種子，按15%（V/V）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃下靜置培養(yǎng)2 d。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基篩選 培養(yǎng)條件用1.2.1中的發(fā)酵培養(yǎng)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖、酵母提取粉、蛋白胨、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、氯化鈉的添加量，考察其對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響。

1.2.3 發(fā)酵條件的篩選及優(yōu)化 在發(fā)酵培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別改變發(fā)酵溫度、種齡、接種量、發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵條件，考察其對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響，并采用正交試驗(yàn)法對(duì)影響活菌數(shù)較大的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 因素水平表

1.2.4 活菌數(shù)的測(cè)定 參照楊文博（2004）提供的方法對(duì)發(fā)酵液中的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，活菌數(shù)以對(duì)數(shù)值表示?；罹鷶?shù)計(jì)算公式：

活菌數(shù)對(duì)數(shù)值 （lg cfu/mL）=某一稀釋度下的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×1/V；

式中：V為接種體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

2.1.1 葡萄糖添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖添加量，分別加入2%、2.5%、3%、3.5%、4%的葡萄糖，于37℃下靜置培養(yǎng)2 d，測(cè)定活菌數(shù)。結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖添加量對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

圖1結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著葡萄糖添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數(shù)隨之增加。當(dāng)葡萄糖添加量為2.5%時(shí)，嗜酸小球菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值達(dá)到8.778 lg cfu/mL。但葡萄糖的添加量繼續(xù)增加，嗜酸小球菌活菌數(shù)下降明顯。主要原因可能為葡萄糖添加量過大，改變了培養(yǎng)基中的C/N，從而影響了嗜酸小球菌的生長(zhǎng)。

2.1.2 酵母提取粉添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響 改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母提取粉的添加量，分別加入 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的酵母提取粉，于37℃下靜置培養(yǎng)2 d，測(cè)定活菌數(shù)，考察酵母提取粉添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響。結(jié)果見圖2。

圖2 酵母提取粉的添加量對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

從圖2中可以看出，隨著酵母抽提粉添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數(shù)也隨之增加。當(dāng)酵母抽提粉添加量為0.3%時(shí)嗜酸小球菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)

值達(dá)到9.152 lg cfu/mL。

2.1.3 蛋白胨添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的蛋白胨，其他條件不變，于37℃下靜置培養(yǎng)2 d，測(cè)定活菌數(shù)，考察蛋白胨添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響。結(jié)果見圖3。

圖3 蛋白胨添加量對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

從圖3可知，在蛋白胨添加量為0.6%~1.0%時(shí)，各處理之間嗜酸小球菌的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值無顯著差異，且蛋白胨添加量超過0.6%，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)。從生產(chǎn)成本考慮，選擇蛋白胨添加量為0.6%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 K2HPO4添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響 在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別于發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、的K2HPO4，其他條件不變，37℃下靜置培養(yǎng)2 d，測(cè)定活菌數(shù)。考察K2HPO4添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 K2HPO4添加量對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

磷是微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是蛋白質(zhì)和核酸合成的必要組成元素。在菌體的生長(zhǎng)、繁殖、代謝中起著極其重要的作用。適量的磷有利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的代謝，磷過量則會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)。從圖4結(jié)果可以看出，隨著K2HPO4添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值也隨之增加。當(dāng)K2HPO4添加量為0.15%時(shí)活菌數(shù)對(duì)數(shù)值達(dá)到最大，為9.226lgcfu/mL。但K2HPO4添加量超過0.15%，嗜酸小球菌活菌數(shù)下降。

2.1.5 CH3COONa添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響 在培養(yǎng)基中分別添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的 CH3COONa， 其他條件不變，于37℃恒溫條件下，靜置培養(yǎng)2 d，測(cè)定活菌數(shù)。結(jié)果見圖5。

圖5 CH3COONa添加量對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

從圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著CH3COONa添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值顯著增加，當(dāng)CH3COONa添加量為0.6%時(shí)嗜酸小球菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值最高。故選擇0.6%CH3COONa添加量作為該培養(yǎng)基最適添加量。

2.1.6 NaCl添加量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響改變培養(yǎng)基中NaCl的添加量，分別在培養(yǎng)基中添加 2%、2.5%、3%、3.5%、4%的 NaCl， 其他條件不變，于37℃恒溫條件下，靜置培養(yǎng)2 d，測(cè)定活菌數(shù)。結(jié)果見圖6。

圖6 NaCl的添加量對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

一般來講，無機(jī)鹽在低濃度下，可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，但濃度太高，會(huì)起到抑菌或殺菌作用。從圖6結(jié)果可知，在一定范圍內(nèi)，隨著NaCl添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值增加。當(dāng)NaCl添加量為3%時(shí)嗜酸小球菌活菌數(shù)最高，其對(duì)數(shù)值為9.826 lg cfu/mL。但NaCl添加量超過3%，嗜酸小球菌活菌數(shù)略下降。由于本研究采用的是生料發(fā)酵技術(shù)，培養(yǎng)基未經(jīng)過高溫滅菌，通過添加NaCl來抑制雜菌的生長(zhǎng)。如果培養(yǎng)基中添加的抑菌物質(zhì)濃度太低，雜菌生長(zhǎng)旺盛，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝副產(chǎn)物的積累以及生長(zhǎng)環(huán)境的改變而影響目的菌的生長(zhǎng)，但NaCl添加量太大，在抑制雜菌的同時(shí)，也抑制了嗜酸小球菌的生長(zhǎng)。

2.2 發(fā)酵條件的篩選

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)基分別放置于 31、34、37、40、43 ℃， 恒溫靜置培養(yǎng)2 d，其他條件不變，測(cè)定活菌數(shù)。結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

細(xì)菌生長(zhǎng)過程中溫度分為最適生長(zhǎng)溫度、最低生長(zhǎng)溫度以及最高生長(zhǎng)溫度。溫度過低時(shí)，菌體代謝活動(dòng)降低甚至停止生長(zhǎng)；溫度過高，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)變性、酶失活、核酸結(jié)構(gòu)遭到破壞等，從而影響微生物的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致微生物的死亡。從圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，活菌數(shù)對(duì)數(shù)值最高，為9.912 lg cfu/mL。

2.2.2 種齡對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響 分別將培養(yǎng) 24、36、48、60、72 h 的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件不變，培養(yǎng)2 d，測(cè)定活菌數(shù)。結(jié)果見圖8。

圖8 種齡對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

種齡也是影響微生物發(fā)酵的主要因素之一。種齡過大，細(xì)胞處于衰亡期，菌體代謝活力降低；而種齡過小，接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，由于種子液中細(xì)胞數(shù)量少，導(dǎo)致延滯期長(zhǎng)，延長(zhǎng)了發(fā)酵周期。從圖8結(jié)果可知，在種齡24~48 h，嗜酸小球菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值隨種齡的增加而增加。當(dāng)種齡為48 h時(shí)，活菌數(shù)對(duì)數(shù)值最高，為10.253 lg cfu/mL。

2.2.3 接種量對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響 按體積比 （V/V）分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10%、15%、20%、25%、30%的液體種子，其他條件不變，37℃發(fā)酵2 d，測(cè)定活菌數(shù)。結(jié)果見圖9。

從圖9可知，嗜酸小球菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值隨接種量的變化明顯。當(dāng)接種量為20%時(shí)，活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為10.869 lg cfu/mL。當(dāng)接種量超過20%，活菌數(shù)明顯下降。接種量過大，由種子液帶到發(fā)酵培養(yǎng)基中的副產(chǎn)物過多，同時(shí)前期菌體量過大，物質(zhì)消耗過快，從而影響或抑制微生物的生長(zhǎng)。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，分別于24、36、48、60、72 h 取樣，測(cè)定活菌數(shù)。 結(jié)果見圖 10。

圖9 接種量對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

從圖10可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，活菌數(shù)對(duì)數(shù)值最大，為10.815 lg cfu/mL。培養(yǎng)時(shí)間超過48 h，活菌數(shù)降低。可能是因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物大量積累。同時(shí)，嗜酸小球菌通過對(duì)糖的代謝產(chǎn)生大量乳酸而使培養(yǎng)基pH值下降，導(dǎo)致菌體停止生長(zhǎng)甚至死亡。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)的變化曲線

2.3 培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度、種齡、接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2極差R可知，影響嗜酸小球菌活菌數(shù)各因素的主次關(guān)系為A＞D＞C＞B，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞種齡。嗜酸小球菌液體發(fā)酵最優(yōu)條件組合為A3B3C2D1，即嗜酸小球菌適宜的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時(shí)間60 h、接種量20%、種齡36 h?；罹鷶?shù)對(duì)數(shù)值為11.258 lg cfu/mL。

3 討論與結(jié)論

培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵條件對(duì)微生物發(fā)酵過程能產(chǎn)生重要的影響 （Carvalho和Mapari，2005；閔麗娥，2001）。如培養(yǎng)基中碳源、氮源種類及比例、碳氮比、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的初始pH、接種量、種齡、培養(yǎng)時(shí)間等。許多研究表明，通過對(duì)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化，能顯著提高發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度（朱承亮，2008；Chiara，2003）。 乳酸菌制劑有效活菌數(shù)是衡量其應(yīng)用效果的主要指標(biāo)。目前，微生物的發(fā)酵方式從滅菌與否可分為熟料發(fā)酵和生料發(fā)酵。由于生料發(fā)酵具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單且能耗低、營(yíng)養(yǎng)成分破壞少等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到微生物工作者的重視。嗜酸小球菌是一種乳酸菌，已有研究表明，該菌在動(dòng)物養(yǎng)殖上具有很好的益生效果（夏耘等，2016；余德光等，2006、2005），但嗜酸小球菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，特別是生料發(fā)酵工藝的研究鮮見報(bào)道。本研究以從健康豬腸道中分離的嗜酸小球菌為研究對(duì)象，采用液體生料發(fā)酵技術(shù)，研究了發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件對(duì)嗜酸小球菌活菌數(shù)的影響，在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法對(duì)嗜酸小球菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件為葡萄糖2.5%、酵母抽提粉0.3%、蛋白胨0.6%、K2HPO40.1%、CH3COONa 0.6%、NaCl 3%、發(fā)酵溫度40℃、種齡60 h、接種量20%、發(fā)酵時(shí)間36 h。在此培養(yǎng)條件下，嗜酸小球菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為11.258 lg cfu/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

[1]郝彥玲，黃榮，趙潞，等.新疆酸馬奶中乳酸片球菌所產(chǎn)細(xì)菌素05-8的理化特性及分子量確定[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2009，11：12～14.

[2]閔麗娥，劉克武，黃裕村，等.幾種碳源和維生素對(duì)紅曲生理活性物質(zhì)生成的影響[J]．釀酒科技，2001，2：23 ～ 24．

[3]夏耘，余德光，謝駿，等.養(yǎng)殖水體添加嗜酸小球菌對(duì)鱖發(fā)育過程腸道微生物構(gòu)成的影響[J].淡水漁業(yè)，2016，46（6）：71 ～ 76.

[4]楊文博 主編.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[5]余德光，謝駿，王廣軍，等.嗜酸小球菌對(duì)日本鰻鱺生長(zhǎng)和免疫的影響[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25（4）：14 ～ 17.

[6]余德光，朱紅友，王廣軍，等．嗜酸小球菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦體液免疫因子的影響[J].海洋水產(chǎn)研究，2006，27（5）：51 ～ 55．

[7]朱承亮.乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)的研究：[碩士學(xué)位論文][D].杭州：浙江大學(xué)，2008.

[8]Albano H，Todorov SD，van Reenen CA，et al.Characterization of two bacteriocins produced by Pediococcus acidi/actici isolated from “Alheira”，a fermented sausage traditionally produced in Portugal[J].Int J Food Microbio1，2007，116（2）：239 ～ 247.

[9]Cosansu S，Kuleasan H，Ayhan K，et al.Antimicrobial activity and protein profiles of Pediococcus spp.isolatedfrom Turkish"Sucuk"[J].Journal of Food Processing and Preservation，2007，31（2）：190 ～ 200.

[10]Cobos MA，Ley de Coss A，Ramirez N D，et al.Pediococcus acidilactici isolated from the rumen of lambs with rumen acidosis，16SrRNA identification and sensibility to monensin and lasalocid[J].Res Vet Sci，2011，90（1）：26 ～ 30.

[11]Carvalho J C，Oishi B O，Pandey A，et al.Biopigments from Monascus：strain selection citrinin production and color stability[J].Brazilian Archives of Biology and Technology，2005，48： 885 ～ 894.

[12]Chiara S ，Vincenzo A ，Vivien V，et al.Cell density cultivation of probiotics and lactic acid production[J].Biotechnology and Bioengineering，2003，82（2） ：213 ～ 222.

[13]Mathys S，Meile L，Lacroix C.Co-cultivation of abacteriocin-producing mixed culture ofBifidobacterium thermophilum RBL67 and Pediococcus acidi/actici UVA1 isolated from babyfaeces[J].JAppl Microbio1，2009，107（1）：36 ～ 46.

[14]Millette M，Dupont C，Shareck F，et al.Purification and identification of the pediocin produced by Pediococcus acidilactici MM33，a new human intestinal strain[J].Appl Microbio1，2008，104（1）：269 ～ 275.

[15]Mapari S A S，Nielsen K F，Larsen T O，et al.Exploring fungal biodiversity for the production of water～soluble pigments as potential natural food colorants[J].Current Opinion in Biotechnology，2005，16：231 ～ 238.

[16]Rodriguez-Palacios A，Staempfli H R，Duffield T，et al.Isolation of bovine intestinal Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici with inhibitory activity against Escherichia coli 0157and F5[J].Journal of Applied Microbiology，2009，106（2）：393 ～ 401.■

In order to improve the viable count of Pediococcus acidilactici by using liquid-state fermentation，the effects of the cultural medium compositions and fermentation conditions on the viable count were studied by using single-factor experiments with the viable count as index.Then the fermentation conditions were optimized by using orthogonal experiment.The results showed that the optimizal medium compositions and fermentation conditions were as follows：glucose 2.5%，yeast extract 0.3%，peptone 0.6%，K2HPO40.1%，CH3COONa 0.6%，NaCl 3%，fermentation temperature 40 ℃，the seed age 60 h，the inoculation amount 20%and the fermentation time 36 h.Under these conditions cultured for 36 h，the viable count of Pediococcus acidilactici reached 11.258 lg cfu/mL.It showed that the liquid fermentation technology was suitable for the production of feeding Pediococcus acidilactici.

Pediococcus acidilactici；uncooked material fermentation；viable count；single-factor experiment；orthogonal experiment

S816.3

A

1004-3314（2017）21-0016-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172104

湖南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016NK2103）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（DFCXY201454）

*通訊作者