楊 軍，孔祥瑞，王讓劍，鄭國華

(福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

福建省茶樹品種資源初步關聯(lián)分析

楊 軍，孔祥瑞，王讓劍，鄭國華

(福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

為挖掘茶樹農(nóng)藝性狀相關的分子標記位點，選用38對SSR引物對43份福建茶樹品種進行多態(tài)性掃描與群體結構分析。在群體遺傳結構分析的基礎上采用Tassel GLM(general linear model)和 MLM(mixed linear model)方法進行標記與農(nóng)藝性狀的關聯(lián)分析。共檢測出238個等位變異，每個位點6.26個等位變異。供試群體的 Shannon 指數(shù)平均值為1.261。通過群體遺傳結構分析將供試材料劃分成3個亞群。以 GLM 分析，發(fā)現(xiàn)8個與種徑、茶類、百粒重和花瓣數(shù)相關聯(lián)的標記，對表型變異的解釋率分別54.3%、13.3%～21.8%、57.2%和50.9%；以MLM分析，發(fā)現(xiàn) 6 個與種徑、茶類和百粒重相關的標記，各標記對表型變異的解釋率分別為54.2%、19.7%～24.2%、31.1%。

茶；SSR；群體遺傳結構；關聯(lián)分析

茶樹是多年生常異花授粉植物，構建群體進行QTL定位難度較大，且時間較長。關聯(lián)分析僅需以自然群體為材料，通過分子標記進行全基因組多態(tài)性掃描，結合目標性狀調(diào)查，就可以發(fā)掘相關聯(lián)的優(yōu)異等位基因。因此，關聯(lián)分析方法比較適合茶樹上目標性狀等位基因的挖掘與輔助育種。關聯(lián)分析的材料一般選擇代表性強，來源廣泛，其中有選擇芝麻、可可核心種質(zhì)[1-2]、秈稻微核心種質(zhì)[3]、全國范圍內(nèi)具代表性的豇豆種質(zhì)[4]、國內(nèi)外大麥品種[5]等進行關聯(lián)分析。同時，近年關聯(lián)分析在植物的抗性、農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀上有較多研究，檢測到煙草赤星病抗性[6]、水稻紋枯病[7]、青稞的穗粒數(shù)、株高等[8]、向日葵分枝性狀[9]、玉米穗行數(shù)[10]、陸地棉葉枝數(shù)[11]、大麥的株高、穗長等[12]、半野生棉仁含油量[13]等顯著關聯(lián)的分子標記。目前使用SSR標記對茶樹農(nóng)藝性狀進行關聯(lián)分析研究的報道相對較少，本研究對43份福建審(認)定茶樹品種材料進行關聯(lián)分析，篩選描述茶樹品種特征特性密切相關的性狀，花、果、常規(guī)生化成分等性狀相關的分子標記，為后期茶樹等位基因發(fā)掘與分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建省審(認)定茶樹品種43個，采集各個材料一芽二葉鮮葉保存在-70℃冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用改進的CTAB法[14]提取茶樹基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行茶樹基因組分子量大小檢測，用756-MC型紫外分光光度計測定茶樹基因組DNA的純度(OD260/280比值)。

1.2.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查數(shù)據(jù) 農(nóng)藝性狀來源于《福建省茶樹品種圖志》[15]調(diào)查數(shù)據(jù)，詳細見表1。

1.2.3 引物合成 參照文獻[16-17]引物序列，序列由上海Sangon公司合成。

1.2.4 PCR擴增和產(chǎn)物鑒定 PCR反應體系為：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL(Mg2+)，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游primer(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL(0.5 U)，模板DNA 1 μL。PCR反應于美國ABI-9600型擴增儀上進行，熱循環(huán)程序為：94℃預變性4 min，使模板DNA 充分變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性45 s，不同溫度條件退火60 s，72℃延伸75 s，重復35個熱循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物統(tǒng)一在反向引物(R)的5′段標記熒光(FAM/TAMRA)，由上海百力格生物科技有限公司合成。擴增產(chǎn)物0.5 μL，GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL，HiDi 9 μL，混勻后使用ABI公司3730XL進行毛細管電泳。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用ABI公司的GeneMapper 4.0軟件，選擇GeneScanTM500 ROXTM作為分子量標準，對每一個擴增出的條帶記錄大小。運用PopGen3.2軟件計算Shannon信息指數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度。應用PIC_CALC引物的PIC值。方差分析采用SAS。

1.2.6 關聯(lián)分析 使用Struture 2.3.4[18]進行群體結構分析，先計算各材料歸屬第k亞群的概率Q值。使用混合模型K值從2設置到9模擬群體結構，每一個K值重復6次。將MCMC迭代設為100000次，初始burn-in次數(shù)為100000。依據(jù)似然值最大原則選取合適的K值為群體數(shù)目，計算Q參數(shù)，將其作為協(xié)變量，并CLUMPP對多次運行結果的進行整合。以SPAGeDi-1.3d處理基因型數(shù)據(jù)獲得個體間親緣關系Kinship矩陣[19]。

采用Tassel 3軟件一般線性模型(GLM)和混合線性模型(MLM)兩種程序進行關聯(lián)分析。GLM分析中，以各親本材料的對應Q值作為協(xié)變量，將SSR標記與花冠直徑、百粒重、氨基酸、種徑等表型性狀進行回歸分析，尋找與之相關聯(lián)的標記，并確定其解釋率；MLM分析中，采用Q+K方法分析，性狀與GLM分析相同，確定關聯(lián)位點，并計算標記對表型變異的解釋率。

表1 茶樹品種農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)

(續(xù)表1)

品種名稱花冠直徑(cm)花瓣數(shù)(片)果實直徑(cm)果皮厚度(cm)一芽三葉重(g)種徑(cm)百粒重(g)茶多酚(%)氨基酸(%)咖啡堿(%)水浸出物(%)茶類大葉烏龍4.662.200.06075.01.6276.2017.54.23.448.3烏龍茶福云20號4.472.150.06796.51.36135.8018.83.93.450.6綠茶春蘭4.271.920.06758.01.41102.4015.63.93.751.4烏龍茶鳳圓春3.372.080.096148.81.4963.4014.55.23.742.7烏龍茶鐵觀音3.261.680.07060.51.25123.9417.44.73.751.0烏龍茶黃觀音3.962.140.08858.01.28112.2019.44.83.448.4烏龍茶杏仁茶3.262.030.050139.61.39139.5015.64.73.745.4烏龍茶紫玫瑰3.262.020.04062.01.31110.7016.34.53.148.4烏龍茶九龍袍4.161.660.07083.01.25126.5818.84.13.249.9烏龍茶福安大白茶3.87NANA98.0NANA15.56.13.451.3綠茶黃奇4.462.120.07165.01.2287.9019.64.24.050.2烏龍茶歌樂茶3.872.080.13180.01.6170.0013.55.73.646.2綠茶黃棪2.9562.100.07059.01.4895.8016.23.53.648.0烏龍茶紫牡丹4.062.020.04054.01.31110.7018.43.94.348.6烏龍茶丹桂4.261.940.06866.01.2390.0017.73.33.249.9烏龍茶大紅袍3.462.350.070NA1.18101.1617.15.03.551.0烏龍茶福云6號3.562.180.08369.01.32108.5814.94.72.945.1綠茶梅占4.161.800.080103.01.35105.3016.54.13.951.7烏龍茶福鼎大毫茶4.7571.800.090104.01.5190.5017.35.33.247.2綠茶福鼎大白茶3.8581.630.06063.01.33118.5014.84.03.349.8綠茶金萱4.072.080.079NA1.4990.5019.24.43.349.9烏龍茶福建水仙4.0571.530.150112.01.47109.4417.63.34.050.5烏龍茶毛蟹4.462.110.10068.51.44119.8614.74.23.248.2烏龍茶金觀音3.672.000.06050.01.51163.6219.04.43.845.6烏龍茶福云5953.472.320.060111.01.6995.4012.54.74.747.3綠茶綠芽佛手4.082.900.096147.01.78100.5016.23.13.149.0烏龍茶肉桂371.860.07053.01.1475.8817.73.83.152.3烏龍茶悅茗香4.161.900.07060.01.26125.8221.43.63.949.4烏龍茶政和大白茶4.87NANA123.0NANA13.55.93.346.8綠茶白芽奇蘭4.071.810.118139.01.2852.0016.43.63.948.2烏龍茶榕春早3.571.850.063NA1.0690.0017.74.63.245.9綠茶春閨3.072.510.090NA1.3575.8013.34.23.841.4烏龍茶

注：NA代表數(shù)據(jù)缺失。

2 結果與分析

2.1 引物多態(tài)性與等位位點分析

從表1中看出，38對SSR標記在參試材料中共檢測到等位位點238個，平均每對引物檢測到6.26個，其中最多為SSR2、SSR16為13個，多態(tài)性十分豐富；38對引物的PIC值在0.255～0.841之間，平均為0.580，篩選出來的引物具有較強鑒定能力；SSR引物的Shannon指數(shù)變幅為0.506～2.158，平均值為1.261，參試茶樹種質(zhì)材料群體間的遺傳變異較大，具有較為豐富的遺傳多樣性。計算觀測雜合度與期望雜合度平均值比較接近，說明篩選的引物檢測到的等位基因在參試材料中分布相對均勻。

2.2 群體遺傳結構分析

利用Structure 2.3.1軟件，基于數(shù)學模型分析由43份材料構成的參試材料的遺傳結構，發(fā)現(xiàn)樣本的等位變異頻率特征類型數(shù)K呈持續(xù)增大趨勢，當K=4時出現(xiàn)峰值，并呈現(xiàn)明顯的拐點(圖1)。由此將43份茶樹親本分為3個類群(圖2)，分別包含9、11和23份。該自然群體結構比較簡單，能夠有效地降低群體結構對關聯(lián)分析產(chǎn)生的影響。

表2 38對引物的擴增結果

圖1 Structure分析中△K隨K值的變化Fig.1 △K value from structure analysis

2.3 SSR標記與部分農(nóng)藝性狀的關聯(lián)分析

GLM分析結果顯示，在所檢測的38個標記中有8個與種徑、茶類、花瓣數(shù)、百粒重顯著相關(P<0.01)。同時，將P值進行蒙特卡羅模擬顯著性檢測(防止偽關聯(lián))，SSR14、SSR15、SSR16、SSR19、SSR26、SSR37達到顯著性標準(P<0.05)，其中5個與茶類相關，1個與種徑相關。各標記對表型變異的解釋率為13.3%～54.3%，解釋率最大的標記是SSR37為54.3%,與種徑相關(見表3)。

MLM分析結果顯示，在所檢測的38個標記中有6個與種徑、茶類、百粒重數(shù)顯著相關(P<0.05)，其中4個與茶類相關，1個與種徑相關，1個與百粒重相關。各標記對表型變異的解釋率為19.7%～54.3%。MLM分析檢測到與農(nóng)藝性狀相關的SSR比GLM分析結果少2個，其中有5個標記與GLM 分析得到的相同，但解釋率均有所上升，但P值標準變大，準確性不如GLM。

3 討論與結論

3.1 GLM與MLM分析結果相比較

本試驗GLM模型關聯(lián)顯著性選擇的P<0.01，而MLM模型關聯(lián)顯著性選擇的P<0.05，與前人研究相一致[20-21]。從P值選擇標準來看，是GLM模型分析結果相對更準確，但李曉娜等[13]認為，GLM模型以各親本材料的對應Q值作為協(xié)變量，MLM模型采用Q+K方法分析，不僅考慮群體結構Q的影響，還考慮兩兩材料間的親緣關系(Kinship)系數(shù)，減少“偽關聯(lián)”的數(shù)目，分析獲得的結果更加準確可靠。5對標記在MLM模型與GLM模型中都檢測達到顯著差異，因此，這5對標記的關聯(lián)分析結果可靠性相對較高。單一模型中達到顯著差異花瓣數(shù)、百粒重性狀，需要進一步檢測。

圖2 K=3時，Structure的運算結果Fig. 2 Calculated results of structure(K=3)

表3 與農(nóng)藝性狀顯著(P<0.05)相關的位點及其對表型變異的解釋率

3.2 關聯(lián)分析結果

本試驗選擇的目標性狀主要參考茶樹品種志中對茶樹品種特征特性的描述，其中，氨基酸、咖啡堿等生化成分未檢測到顯著相關的分子標記，推測是參試材料較少、引物數(shù)量不足與常規(guī)生化成分受年份、取樣等因素影響較大。茶樹品質(zhì)相關基因的挖掘一直是茶樹輔助育種與資源鑒定的重點，尤其是烏龍茶香氣、滋味相關品質(zhì)基因。烏龍茶香氣、滋味品質(zhì)是在加工過程中形成，目前還沒有明確受主要影響因子控制，推測是多基因共同起作用的。烏龍茶與綠茶間最大的品質(zhì)特征差異是香氣、滋味品質(zhì)，茶類性狀有可能與烏龍茶滋味、香氣品質(zhì)相關，參考前人研究對福建省茶樹品種進行烏龍茶與綠茶分類，利用分子標記進行掃描與關聯(lián)分析。從中篩選到5對與茶類顯著相關的標記，連鎖群參考Ma Jian-qiang[16]等的研究結果，5對標記位于不同的連鎖群，初步說明茶類性狀是多位點，多基因共同控制，與實驗預期一致。以這些標記作為組合，可以初步鑒定福建野生資源、地方資源的遺傳組成偏向綠茶或烏龍茶，進行雜交親本輔助選擇。同時，進行綠茶與烏龍茶雜交時，在幼齡期具有綠茶表型性狀群體中，選擇具有烏龍茶遺傳組成的后代，可以初步輔助選擇高香綠茶新品系。

致謝：感謝試驗過程中陳常頌研究員等人的支持。

[1]王蕾,黎冬華,齊小瓊,等.芝麻核心種質(zhì)芝麻素和芝麻酚林的關聯(lián)分析[J].中國油料作物學報,2014,36(1):32-37.

[2]李付鵬,秦曉威,郝朝運,等.可可核心種質(zhì)遺傳多樣性及果實性狀與 SSR 標記關聯(lián)分析[J].熱帶作物學報,2016,37(2):226-233.

[3]邱先進,袁志華,陳凱,等.用全基因組關聯(lián)分析解析秈稻堊白的遺傳基礎[J].作物學報,2015,41(7):1007-1016.

[4]潘磊,李依,余曉露,等.豇豆產(chǎn)量性狀與 SSR 分子標記的關聯(lián)分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2015,54(16):3952-3962.

[5]司二靜,張宇,汪軍成,等.大麥農(nóng)藝性狀與 SSR 標記的關聯(lián)分析[J].作物學報,2015,41(7):1064-1072.

[6]朱承廣,任民,蔣彩虹,等.以關聯(lián)分析發(fā)掘煙草抗赤星病基因分子標記[J].中國煙草科學,2017,38(1):68-72.

[7]孫曉棠,盧冬冬,歐陽林娟,等.水稻紋枯病抗性關聯(lián)分析及抗性等位變異發(fā)掘[J].作物學報,2014,40(5):779-787.

[8]孟亞雄,孟林祎,汪軍成,等.青稞遺傳多樣性及其農(nóng)藝性狀與 SSR 標記的關聯(lián)分析[J].作物學報,2016,42(2):180-189.

[9]劉勝利,段維,王鵬,等.向日葵分枝和株高性狀的關聯(lián)分析定位研究[J].海南熱帶海洋學院學報,2017,24(2):80-84.

[10]張煥欣,翁建峰,張曉聰,等.玉米穗行數(shù)全基因組關聯(lián)分析[J].作物學報,2014,40(1):1-6.

[11]梁冰,范術麗,宋美珍,等.陸地棉農(nóng)藝性狀與SSR標記的關聯(lián)分析[J].棉花學報,2014,26(5):387-395.

[12]賴勇,王鵬喜,范貴強,等.大麥SSR標記遺傳多樣性及其與農(nóng)藝性狀關聯(lián)分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學2013,46(2):233-242.

[13]李曉娜,蔡小彥,Kiflom Weldu OkubazghP,等.半野生棉棉仁含油量與SSR標記的關聯(lián)分析[J].棉花學報,2015,27(2):104-110.

[14]金基強,崔海瑞,龔曉春,等.用EST-SSR標記對茶樹種質(zhì)資源的研究[J].遺傳,2007,29(1):103-108.

[15]陳常頌、余文權、王慶森等等.福建省茶樹品種圖志[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社,2016:16-104.

[16]Ma Jian-qiang,Yao Ming-zhe,Ma Chun-lei,etal. Construction of a SSR-based genetic map and identification of QTLs for catechins content in tea plant(Camelliasinensis)[J].PLOS ONE,2014,9(3):1-11.

[17]段云裳,姜燕華,王麗鴛,等.中國紅、綠茶適制品種(系)遺傳多樣性與親緣關系的SSR分析[J]．中國農(nóng)業(yè)科學,2011,44(1):99-109．

[18]Prichard J K, Stepphen M, Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J]. Genetics, 2000(155):945-959.

[19]Earl D A. STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method[J]. Conserv Genet Resour, 2012(4):359-361.

[20]郭志軍,趙云雷,陳偉,等．陸地棉SSR標記遺傳多樣性及其與農(nóng)藝性狀的關聯(lián)分析[J]．棉花學報,2014,26(5):420-430.

[21]馮英娜,柳李旺,劉衛(wèi)東,等．茄子SSR遺傳多樣性及其農(nóng)藝性狀的關聯(lián)分析[J]．江蘇農(nóng)業(yè)學報,2014,30(4):839-847．

APreliminaryReportonAssociationAnalysisofTeaVarietiesinFujian

YANG Jun, WANG Rang-jian, KONG Xiang-rui, ZHENG Guo-hua

(TeaResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences/FujianBranch,NationalCenterforTeaImprovement,Fu’an,Fujian355015,China)

To identify the molecular marker loci related to specific tea agronomic traits, 38 simple sequence repeat (SSR) markers were selected for the polymorphism detection and population structure analysis on 43 tea varieties found in Fujian. The population structure was analyzed based on the polymorphic SSR markers, while the association between the markers and agronomic traits was determined by fitting the data to TASSEL general linear model (GLM) and mixed linear model (MLM). A total of 238 alleles were detected in the 43 tea varieties with an average count of 6.26. The averaged Shannon’s index was 1.261. The structure analysis showed 3 genetic subpopulations for the varieties tested. The association of markers and traits based on GLM showed 8 SSR markers relating to the seed stem, tea type, hundred-grain weight and flower petal count of a plant, with the phenotypic contributions of 54.3%, 13.3%～21.8%, 57.2%, and 50.9%, respectively. Whereas, MLM indicated that 6 SSR markers closely related to the seed stem, tea type, and hundred-grain weight, with the phenotypic contributions of 54.2%, 19.7%～24.2% and 31.1%, respectively.

tea plant; SSR; population structure; association analysis

S571.1

A

2096-0220(2017)03-0115-06

2017-06-27初稿；2017-08-11修改稿

福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(茶葉)產(chǎn)業(yè)技術體系建設項目(2014～2017)；福建省屬公益類科研院所基本科研專項(2015R1012-7、2017R1012-6)；福建省自然科學基金項目(2015J01098)；福建省農(nóng)業(yè)科學院茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新團隊項目(STIT 2017-3-12)。

楊軍(1981-)，男，助理研究員，從事茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail:yangjun007@qq.com