劉明明，牛治鑫，周永忠，胡淑婷

·論 著·

慢性心衰大鼠心肌細胞內雷尼丁受體及其調節(jié)蛋白Calstabin2表達異常的研究

劉明明，牛治鑫，周永忠，胡淑婷

目的研究慢性心衰大鼠心肌細胞肌漿網雷尼丁受體及其調節(jié)蛋白FK506結合蛋白(Calstabin2)的異常表達。方法雄性SD大鼠25只，按照3∶2的比例隨機分為心衰組(15只)和假手術組(10只)，運用激光掃描共聚焦顯微鏡、Western-blot等方法研究2組大鼠心肌細胞肌漿網內鈣容量及鈣釋放通道雷尼丁受體(RyR2)和其調節(jié)蛋白Calstabin2表達的變化。結果慢性心衰大鼠心功能LVEDP(8.91±2.16)mmHg、dp/dtmax(2 250.19±172.44)mmHg/s，顯著低于假手術組大鼠心功能LVEDP(4.17±1.15)mmHg、dp/dtmax(4 822.54±221.62)mmHg/s(Plt;0.05)；慢性心衰大鼠心肌細胞肌漿網內鈣容量ΔF/F0=25.3±2.8，顯著低于假手術組大鼠肌漿網內鈣容量ΔF/F0=47.8±3.5(Plt;0.05)；慢性心衰大鼠心肌細胞內Calstabin2的表達較對照組下調。結論Calstabin2的表達下調所致RyR2穩(wěn)定性下降是導致心衰的原因之一。

心力衰竭；肌漿網；雷尼丁受體；FK506結合蛋白

近年來，心血管疾病逐漸威脅到人類的健康，在致死性疾病中居于首位。心力衰竭是所有心臟疾病發(fā)展的終末階段，病理生理學特點為心輸出量降低，重要臟器組織灌注不足，體循環(huán)或肺循環(huán)充血[1]。各種導致心衰的原因中，心室肌細胞內鈣離子通道狀態(tài)以及調控鈣離子通道的蛋白異常是其發(fā)病的主要原因之一[2]。本實驗以大鼠慢性心衰模型作為研究對象，通過激光掃描共聚焦顯微鏡和免疫印跡等技術對慢性心衰的發(fā)病機制進行討論和研究。

1 材料與方法

1.1 材料：選用標準雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠25只，體質量200～250 g，按照3∶2的比例隨機分為心衰組即心梗手術組(n=15)和假手術組(n=10)。試劑：Fluo-5N/AM熒光染料購于Biotium公司，用二甲基亞砜溶解備用；RyR antibody和Calstabin2 antibody均購于Abcam公司；Ⅱ型膠原酶、小牛血清蛋白、HEPES等購于Sigma公司。

1.2 建構大鼠慢性心衰模型：2組大鼠都用20%氨基甲酸乙酯進行腹腔注射麻醉(3.5 mL/kg)，將已麻醉的大鼠固定在鼠臺上，手術暴露氣管，然后行經喉氣管插管，連接動物呼吸機，手術逐層開胸，暴露心臟，穿線并結扎冠狀動脈左前降支(LAD)(假手術組僅做LAD穿線，并不結扎)。術后觀察20 min左右大鼠心電圖穩(wěn)定以后手術關閉胸腔，待其蘇醒恢復自主呼吸后回籠飼養(yǎng)[3-4]。手術前后，均應記錄大鼠的心電圖，當Ⅱ導聯(lián)ST段出現(xiàn)弓背上抬時，說明冠狀動脈左前降支結扎成功(圖1-圖2，目錄后)。2組大鼠均飼養(yǎng)28 d，自由飲食。

模型建立28 d(4周)后，分別觀察并記錄2組大鼠的各項心功能指標，包括心率(HR)、左心室壓力的最大上升速率(dp/dtmax)和左心室壓力的最大下降速率(dp/dtmin)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)。

1.3 分離大鼠心室肌細胞后運用膠原酶Ⅱ消化法分離2組大鼠的心室肌細胞[5]：首先用20%氨基甲酸乙酯進行腹腔注射麻醉(3.5 mL/kg)，將大鼠全身肝素化，立即開胸剪下大鼠心臟放入無鈣臺式液(0 ℃)中清洗；然后主動脈逆行插管，結扎、固定后將心臟懸掛于Langendorff裝置下，依次行無鈣臺式液逆行灌流(5～7 min)、臺式液灌流 (8～10 min)；隨后將心室剪下(心衰組在梗死區(qū)部位取材)，置于改良的Kraft-Bruhe(KB)液(37 ℃)中，將心室肌剪碎并吹打2 min，通過過濾獲得單個心室肌細胞，再將其沉淀10～15 min后置于改良的KB液中，室溫下靜置1～1.5 h后用于檢測Ca2+容量。

1.4 大鼠心肌細胞肌漿網內鈣容量的檢測:以熒光染料Fluo-5N/AM將2組心肌細胞孵育好后放置于細胞營養(yǎng)液中，用激光共聚焦掃描顯微鏡記錄SR內的Ca2+容量，選用40倍油鏡，孔徑大小(NA)為1.25 mm，發(fā)射波波長500～560 nm，激發(fā)光為波長488 nm的氬光。激光共聚焦顯微鏡的成像方式為面掃描(xyz)，采樣速率20 s/幀。所有實驗均在室溫20～22 ℃的條件下進行。Fluo-5N/AM是一種肌漿網鈣熒光探針，可以與Ca2+結合，能特異性地顯示肌漿網內Ca2+的變化，直接測定SR內Ca2+容量。用matlab 6.5軟件處理圖像，通過標準熒光強度的凈變化來表示鈣瞬變的強弱，即ΔF/F0= (F-F0)/F0(F0代表本底的熒光強度；F：代表某一時間點的熒光強度)。

1.5 測定蛋白的表達:提取大鼠心肌細胞膜蛋白，即取2組大鼠左心室肌組織(心衰組取梗死區(qū)部位)100 mg，剪碎心肌組織，置于離心管中，同時加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，在高速勻漿器中將其打碎，離心5 min(4 ℃，4 000 r/min)；然后吸取上清液，置于超速離心管中離心1 h(4 ℃，12 000 r/min)，加適量的細胞裂解液在沉淀物中，測定其膜蛋白濃度(Bradford法)并將其保存于-80 ℃冰柜中備用。分別取2組樣本25 μg，在沸水(95 ℃)中煮沸5 min，待溫度下降后行SDS-PAGE電泳，然后電轉移(110 V，60 min)置硝酸纖維膜上。膜封閉后分別用RyR antibody和Calstabin2 antibody(一抗)孵育，然后漂洗，用二抗孵育、漂洗后顯色，隨后曝光3 min。最終將膠片掃描至計算機行蛋白條帶灰度分析，分別計算RyR2和Calstabin2蛋白半定量表達水平(RyR2/Actin，Calstabin2/Actin)。

2 結果

2.1 2組大鼠心功能指標的比較:術后4周檢測2組大鼠的心功能顯示，心衰組大鼠LVEDP與假手術組相比明顯升高(Plt;0.05)，左心室壓力最大上升速率(dp/dtmax)、最大下降速率(dp/dtmin)與假手術組相比顯著下降(Plt;0.05)，提示心衰組大鼠心室的收縮能力下降，符合慢性心衰標準，說明本次造模成功，見表1。

表1 2組大鼠心功能指標的檢測

2.2 2組大鼠肌漿網內鈣容量的檢測：2組大鼠心肌細胞經Fluo-5N/AM孵育后，采用激光掃描共焦顯微鏡面掃描模式(xyz)記錄單個心肌細胞SR內Ca2+容量。結果顯示，心衰組大鼠單個心肌細胞Fluo-5N染色后熒光強度明顯低于假手術組，且熒光強度變化的平均值(ΔF/F0)心衰組組(25.3±2.8，12個心肌細胞)較手術組(47.8±3.5，12個心肌細胞，Plt;0.05)顯著降低，提示心衰組大鼠心肌細胞肌漿網內Ca2+容量低于假手術組。

2.3 RyR2和其調節(jié)蛋白Calstabin2的表達:采用免疫印跡技術測定2組大鼠心肌細胞SR鈣離子釋放通道雷尼丁受體(RyR2)及其調節(jié)蛋白FK506結合蛋白(Calstabin2)表達量的變化，結果顯示RyR2的表達量心衰組與假手術組相比，差異無統(tǒng)計學意義(n=6，Pgt;0.05)；Calstabin2的表達心衰組較假手術組明顯下降(n=6，Plt;0.05)，見圖3(目錄后)。

3 討論

慢性心衰的發(fā)生是由于各種慢性心臟病變和長期心室前、后負荷過重，導致心室肌收縮力減弱，最終使得心搏出量減少，靜脈淤血，不能滿足機體代謝需要的一種心臟疾病。導致心衰的因素中，鈣通道的狀態(tài)以及鈣離子調控異常是其發(fā)生的主要原因之一[6-9]。心肌細胞內Ca2+循環(huán)由Ca2+的釋放和回攝兩個部分組成，Ca2+通過心肌細胞T管上的L-型鈣通道(DHPR)和肌漿網上的雷尼丁受體(RyR2)完成鈣誘導鈣釋放(Ca2+induced Ca2+release,CICR)的全過程。我們之前的研究證明[10]，慢性心衰大鼠心肌細胞L-型鈣通道(DHPR)表達的降低將導致心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)過程異常，從而使得心肌的收縮功能受到影響。本實驗在先前研究基礎上進一步探討慢性心衰大鼠心肌細胞SR鈣離子釋放通道RyR2及其調節(jié)蛋白Calstabin2的異常。

Fluo-5N/AM作為一種肌漿網Ca2+熒光探針，可直接用于測定SR內Ca2+容量。本實驗結果顯示，心衰組大鼠心肌細胞熒光強度比假手術組有明顯下降，且心衰組ΔF/F0與假手術組相比也明顯降低，說明心衰組大鼠心肌細胞SR內Ca2+容量低于假手術組，此結果可能導致心衰組大鼠在興奮-收縮耦聯(lián)過程中經RyR2 釋放的Ca2+量減少，從而導致心肌收縮力降低。

RyR2是存在于心肌細胞肌漿網膜上的一種Ca2+釋放通道，其功能主要是通過鈣誘導鈣釋放的方式介導肌漿網內的Ca2+釋放[11]。RyR2是同源四聚體細胞內鈣離子釋放通道大家族成員之一，其分子量大，貫穿于肌漿網膜并包含大量的N末端結構域。RyR2分子上包含很多調節(jié)蛋白，如鈣調蛋白(Calmodulin，CaM)、FK506結合蛋白(Calstabin 2)、可溶抗藥性相關鈣結合蛋白(Sorcin)、集鈣蛋白(calsequestrin)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)等[12]。其中，F(xiàn)K506結合蛋白(Calstabin2)對RyR2通道功能的調節(jié)尤為重要。Calstabin2是一種順反式肽基脯氨酰異構酶，在RyR2上的結合比例為4∶1。Calstabin2作為RyR2的調節(jié)蛋白，具有穩(wěn)定RyR2通道關閉的功能。有研究表明[13]，該基因敲除的小鼠存在著不同程度的Ca2+滲漏。本次研究表明，心衰組RyR2蛋白表達水平與假手術組相比無明顯差異，但Calstabin2的表達水平心衰組與假手術組相比顯著降低。由于Calstabin2的作用在于穩(wěn)定雷尼丁通道的開放，心衰組Calstabin2表達量降低使得其對RyR2穩(wěn)定性作用下降，導致RyR2在心臟舒張期也部分開放，造成異常的Ca2+泄漏，從而使得肌漿網內的Ca2+容量減少，最終導致心肌細胞SR興奮-收縮耦聯(lián)過程中的Ca2+釋放減少，心肌收縮力降低，進而出現(xiàn)心力衰竭。鑒于RyR2的調節(jié)蛋白種類繁多，將在今后的實驗中進一步探討其他相關蛋白的分子機制。

總之，本實驗結果表明，慢性心衰大鼠心肌細胞RyR2調節(jié)蛋白Calstabin2表達水平下調，使得RyR2在舒張期部分開放泄漏過多Ca2+，導致興奮-收縮耦聯(lián)過程中由RyR2釋放的Ca2+減少，造成心肌收縮力降低，最終導致心衰。

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Abnormalintracellularryanodinereceptoranditsregulatoryproteincalstabin2inchronicratheartfailure

LIUMingming,NIUZhixin,ZHOUYongzhong,HUShuting.

PhysiologyDepartment,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Correspondingauthor:HUShuting,Email: hst7312@163.com

ObjectiveTo study abnormal intracellular ryanodine receptor and its regulatory protein Calstabin2 in chronic rat heart failure (HF).MethodsAdult male SD rats were randomized to divided into myocardial infarction (MI) group and sham operation group.We investigated the sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+content and assessed the expression of ryanodine receptor (RyR2) and Calstabin2 by using laser scanning confocal microscope and Western-blot.ResultsThere was a significant increase in the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) in HF rats (8.91±2.16 mmHg,n=15) compared with sham rats (4.17±1.15 mmHg,n=10,Plt;0.05).There was a significant decrease in the maximal change of systolic pressure over time (dp/dtmax) in HF rats (2 250.19±172.44 mmHg/s,n=12) compared with control rats (4 822.54±221.62 mmHg/s,n=10,Plt;0.05). SR Ca2+content was dramatically reduced in HF myocytes(ΔF/F0=25.3±2.8,n=12) compared with sham myocytes (ΔF/F0=47.8±3.5,n=12,Plt;0.05).The expression of Calstabin2 was significantly reduced in HF rat compared with sham group.ConclusionStability decrease of RyR2 that due to down-regulation of Calstabin2 could contribute to HF.

Heartfailure;Sarcoplasmicreticulum;Ryanodinereceptor;Calstabin2

10.13621/j.1001-5949.2017.10.0865

R541.6

A

寧夏自然科學基金資助項目(NZ15082)

寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學系，寧夏 銀川 750004

劉明明(1986-)男，在讀碩士研究生，主要從事心血管生理研究方向。

胡淑婷，Email:hst7312@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171018.1102.020.html

2016-04-02責任編輯馬興忠